16S rDNA測序技術在嬰兒腸道微生態研究中的應用*

馬麗亞,王輝林,陳 睿,張 敏，黃 艷,盧光進△

(深圳市寶安區婦幼保健院:1.新生兒科;2.中心實驗室 518133)

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·論 著·

16S rDNA測序技術在嬰兒腸道微生態研究中的應用*

馬麗亞1,王輝林2,陳 睿1,張 敏1，黃 艷1,盧光進1△

(深圳市寶安區婦幼保健院:1.新生兒科;2.中心實驗室 518133)

目的 探討16S rDNA測序技術在新生兒、嬰兒腸道微生態研究中的應用。方法 于生后3天、1月、6月、1歲時收集2例健康嬰兒糞便標本共8份，提取細菌總DNA，以Illumina Hiseq 2000為測序平臺，采用新一代高通量16S rDNA宏基因組測序技術對V6可變區測序，并進行生物信息分析(物種分類和豐度分析；多樣性分析)。結果 8份樣品共產生原始測序數據為1 027.47 Mbp，Unique tags序列數量均值為58630，OTU數量63～209；優勢菌門為Proteobacteria和Firmicutes； 在科水平，>1%的物種1個月之內2～4種，6月后達7～10種；1號嬰兒一直以Enterobacteriaceae占優勢，2號嬰兒優勢菌群包括Enterobacteriaceae、Lachnospiraceae、Streptococcaceae和Bacteroidaceae；4個時間點的npShannon和Simpson指數分別為1.17、1.29、2.16、2.51和0.43、0.40、0.26、0.14。結論 16S rDNA測序技術能滿足新生兒、嬰兒腸道微生態研究需求；新生兒、嬰兒糞便中含豐富細菌基因組；細菌物種豐度及分類存在個體差異；從出生到1歲，嬰兒腸道菌群結構趨向復雜和多樣。

腸道菌群; 測序; 宏基因組; 嬰兒

寄居于人體內(主要是腸道)的細菌基因組是人體自身基因組的100多倍[1-2]，被稱為人類的“第二基因組”[3]，腸道菌群對營養物質的消化、吸收、對抗病菌及免疫調節都發揮著重要作用[4]。新生兒、嬰兒期是人體腸道菌群定植并發育的重要階段，此期腸道菌群的失衡可能影響遠期甚至成年后的健康[1]。因而，了解新生兒、嬰兒期腸道菌群的發展模式及特點對研究相關疾病、改善人口質量有重要意義。

對腸道微生態的研究以往多采用培養或傳統分子生物學(如PCR、變性梯度凝膠電泳)方法，但它們對于研究復雜的腸道菌群有明顯的局限性，而宏基因組學研究則可以避免上述方法的缺陷[5]。最近，有關中國嬰兒腸道宏基因組的研究初見報道[6]，但缺乏連續性研究和新生兒資料，本研究擬采用以Illumia為測序平臺的16S rDNA新一代高通量測序技術對2例健康嬰兒從新生兒期至1歲以內的糞便細菌基因組進行連續分析，探討該方法在新生兒、嬰兒腸道微生態研究中的應用，為以后大規模研究中國嬰兒腸道菌群分布特征及嬰兒腸道微生態相關疾病提供參照。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2例間隔1周出生于深圳市寶安區婦幼保健院同一病區的健康足月新生兒為研究對象，追蹤至1歲。2例嬰兒胎齡分別為38周、39周，均為女孩，剖宮產出生，無胎膜早破，無產時窒息，母親術后預防性應用頭孢唑啉2劑，生后一直混合喂養至1歲。本課題經本院倫理委員會同意并獲得了嬰兒父母的知情同意。

1.2 糞便標本的留取及提取細菌總DNA 生后3 d(時間點標注為a)、1月(標注為b)、6月(標注為c)和1歲(標注為d)時用無菌標本盒留糞便不少于10 g，1 h內冷凍于-70 ℃，留取糞便前1周嬰兒不使用抗生素、益生菌，如有疾病，可暫緩1周留取。在本院中心實驗室采用德國Qiagen公司生產的QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便細菌總DNA，保存于-70 ℃，具體步驟由專人按說明書操作。DNA標本于冷藏條件下送至深圳華大基因科技服務有限公司進行測序及生物信息分析。

1.3 16S rDNA測序 用細菌通用引物對糞便DNA樣品進行16S rRNA基因V6區PCR擴增，然后回收電泳主要的DNA片段后構建文庫，制備cluster；應用Hiseq 2000測序儀(Illumina公司，美國)對擴增的16S rDNA高變區序列進行測序，測序區域為V6區，長度為100 bp，測序類型為101 PE測序。

1.4 生物信息分析

1.4.1 物種分類與豐度分析 對原始測序數據處理后獲取clean data，拼接成tags；利用Mothur (version 1.27.0)軟件包對tags序列進行了去冗余處理，從中挑選出unique tags序列并進行物種注釋，聚類成Operational Taxonomic Units (OTU)，Tags和OTU的數量初步說明了該樣品是否具有豐富的物種；然后通過OTU 注釋(基于包含的tags的物種注釋結果)完成物種組成和分類分析，可在界、門、綱、目、科、屬、種水平，將每個注釋上的物種或OTU在不同樣品中的序列數進行整理。

1.4.2 多樣性分析 利用Mothur(version 1.27.0)軟件計算針對單個樣品物種多樣性分析的Alpha多樣性值，包括chao1值、ACE值、Shannon、npShannon以及Simpson指數[7]，前面4個指標數值越大，最后一個指標越小，說明樣品中的物種越豐富。

2 結 果

2.1 樣品測序數據 8份糞便細菌總DNA樣品共產生原始測序數據為1 027.47 Mbp，每份樣品平均產生124.53 Mbp的clean data序列，每一樣品信息的利用率都在94%以上，出生僅3 d時已含豐富的細菌基因組。

2.2 物種分類和豐度分析 各樣品檢測的Tags數量平均為69 840，Unique tags序列數量均值為58 630；OTU數量63～209，隨著年齡的增長而增加，3 d、1月、6月和1歲時平均為67、86、149和176，表明嬰兒糞便樣品中微生物豐度隨時間而增加。在門(Phylum)水平，20個菌門被檢出細菌基因組，但主要分布于變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)2個菌門，2例嬰兒糞便中比例差異有統計學意義。另外，2號嬰兒的擬桿菌門(Bacteroidetes)在1歲時上升至22%。見表1。

表1 門水平主要細菌占比情況表[tags數量及百分比，n(%)]

注：a、b、c、d分別代表3 d、1月、6月、1歲4個時間點。

本研究中最佳的分類水平為科，每個樣品均有80%以上的Tags在該水平上得到分類。在科水平，2例嬰兒腸道菌群中超過1%的物種1個月之內僅2～4種，6月后達7～10種。1號嬰兒一直以Proteobacteria下的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)占優勢，其他包括Firmicutes下的梭菌科(Clostridiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)等，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)一直未超過1%。2號嬰兒優勢菌群包括Enterobacteriaceae以及Firmicutes下的毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)和Bacteroidetes下的擬桿菌科(Bacteroidaceae)，雙歧桿菌科最高時也僅7.3%。

表2 樣品在0.03距離下的不同時間點Alpha豐富 程度各指數均值

2.3 樣品多樣性分析 3 d、1月、6月及1歲時chao1值、ACE值、Shannon、npShannon值越來越大，而Simpson指數越來越小，提示糞便中菌群多樣性隨著時間而增加，物種越來越豐富。見表2。

3 討 論

高通量測序技術又稱新一代或第二代測序技術，以邊合成邊測序為原理，可以一次性對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行序列測定，而以Illumina為測序平臺的測序技術在研究人類腸道宏基因組方面發揮著舉足輕重的作用[2-3,6,8]。16S rDNA是細菌進化以及分類研究最常用的靶分子，16S rDNA宏基因測序技術不需進行克隆篩選，測序的通量高，獲得的數據量大，周期短，與傳統的培養鑒定和PCR、變性梯度凝膠電泳、原位雜交等分子生物學方法相比，能更全面反映微生物群體的物種組成、分布及豐度信息。本研究對2例剖宮產出生、混合喂養的健康嬰兒糞便標本于1歲之內連續進行16S rDNA的V6高變區新一代高通量測序，8份糞便細菌總DNA樣品共產生原始測序數據為1 027.47 Mbp，每份樣品平均產生124.53 Mbp的clean data序列。Barrett等[9]對10例早產兒生后2周和4周的糞便標本進行16S rDNA的V4區進行測序分析(Genome Sequencer FLX測序平臺，Roche Diagnostics Ltd,West Sussex，UK)，20份標本共產生529 102 bp原始序列和452 863 bp clean data 序列，本研究測序數據多于Barrett等對于早產兒、新生兒的報道，原因可能與測序平臺、嬰兒胎齡、日齡不同有關，同時也表明以Illumina為測序平臺的16S rDNA測序技術能夠滿足新生兒、嬰兒腸道微生態研究的需求。

影響新生兒腸道菌群定植的因素包括分娩方式[10]和喂養方式[6]等，例如，剖宮產出生的嬰兒其腸道菌群多樣性減少、益生菌擬桿菌門定植延遲[10]；母親腸道是陰道分娩嬰兒腸道菌群定植的發源地，而母乳中的細菌以及通過吸吮接觸乳頭周圍的皮膚是母乳喂養嬰兒腸道菌群的重要來源[1]；母親圍生期使用抗菌藥物可改變其嬰兒腸道菌群結構[11]。本研究中 2例嬰兒雖然出生環境及圍產期因素相似(同一產區、均為剖宮產出生、混合喂養、母親產時均有預防性抗菌藥物應用)，但糞便中的菌群分布卻有明顯的差異，說明除了以上常見影響因素外，尚有其他影響嬰兒腸道細菌定植的因素，如地域[11]，家庭環境(如寵物)或兄弟姐妹的影響[12]等，從而造成嬰兒腸道宏基因組獨特的個體特征，但這些結論還需要大標本、多地域人群的連續研究來證實。另外，常見的益生菌雙歧桿菌科在2例嬰兒腸道中的比例均較低，與Fan等[6]的研究類似。

不同于Fan等[6]僅一個時間點的研究，本研究表明，新生兒出生僅3 d時腸道中已含有豐富的細菌基因組，從出生到1歲，嬰兒糞便中細菌豐度及多樣性隨時間而增加，提示隨著嬰兒飲食結構的復雜和個體的發育，以及活動范圍的擴展，嬰兒腸道菌群結構趨向復雜和多樣。但值得注意的是，出生不久即定植的優勢菌群，1歲以內可能會一直存在，例如1號嬰兒腸道中一直以腸桿菌科占優勢，而2號嬰兒腸道中自1月時出現的毛螺旋菌科此后亦一直為優勢菌群，說明生命早期的因素可能會影響1歲以內甚至兒童、成人期的腸道菌群結構。

本研究提示，16S rDNA測序技術能滿足新生兒、嬰兒腸道微生態研究需求；嬰兒糞便中含豐富細菌基因組；細菌物種豐度及分類存在個體差異；從出生到1歲，嬰兒腸道菌群結構趨向復雜和多樣；本研究將為未來新生兒、嬰兒的大樣本、分組研究提供線索。

[1]Matamoros S,Gras-Leguen C,Le Vacon F,et al.Development of intestinal microbiota in infants and its impact on health[J].Trends Microbiol，2013，21(4):167-173.

[2]Qin J,Li R,Raes J,et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature，2010，464(7285):59-65.

[3]Song S,Jarvie T,Hattori M.Our second genome-human metagenome:how next-generation sequencer changes our life through microbiology[J].Adv Microb Physiol，2013，62:119-144.

[4]Di Mauro A,Neu J,Riezzo G,et al.Gastrointestinal function development and microbiota[J].Ital J Pediatr，2013，39:15-18.

[5]丁賢,殷波,李慧賢,等.宏基因組學在微生物活性物質篩選中的應用[J].中國微生態學雜志,2010，22(6):565-568

[6]Fan W,Huo G,Li X,et al.Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in infants during the six months of life[J].J Microbiol Biotechnol，2014，24(2):133-143.

[7]Kemp PF,Aller JY．Bacterial diversity in aquatic and other environments：what 16S rDNA libraries can tell us[J]．FEMS Microbiol Ecol，2004，47(2)：161-177.

[8]Qin J,Li Y,Cai Z,et al.A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J].Nature，2012，490(7418):55-60.

[9]Barrett E,Kerr C,Murphy K,et al.The individual-specific and diverse nature of the preterm infant microbiota[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2013，98(4):F334-F340.

[10]Jakobsson HE,Abrahamsson TR,Jenmalm MC,et al.Decreased gut microbiota diversity,delayed Bacteroidetes colonisation and reduced Th1 responses in infants delivered by Caesarean section[J].Gut，2014，63(4):559-566.

[11]Fallani M,Young D,Scott J,et al.Intestinal microbiota of 6-week-old infants across Europe:geographic influence beyond delivery mode,breast-feeding,and antibiotics[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr，2010，51(1):77-84.

[12]Azad MB,Konya T,Maughan H,et al.The gut microbiome and the hygiene hypothesis of allergic disease.Impact of pets and siblings on infant gut microbiota[J].Ann Am Thorac Soc，2014，11(Suppl 1):S73-S76.

Application of 16S rDNA sequencing technique in infantile intestinal microecological research*

MALi-ya1,WANGHui-lin2,CHENRui1,ZHANGMin1,HUANGYan1,LUGuang-jin1

(1.DepartmentofNeonatology;2.CentralLaboratory,ShenzhenBao′anDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518133,China)

Objective To investigate the application of 16S rDNA sequencing technique in studying intestinal microecology of neonates and infants.Methods Eight fecal samples were collected on 3 d,1 month,6 months and 1 year in 2 healthy infants.Total bacterial DNAs were extracted and submitted the high throughout 16S rDNA sequencing on the V6 viable region by using Illumia genome analyzer Hiseq 2000 (101 bp pair-end sequencing strategy).The 16S rDNA tags and operational taxonomic units (OTU) were then obtained from the sequences.The bioinformatic analysis including analysis of taxonomy,abundance and alpha diversity were performed.Results Total 1 027.47 Mbp raw data were produced.The mean unique tags number was 58630.The OTU numbers ranged from 36 to 308.The bacterial families more than 1% were increased from 2-4 species per sample before 1 month to 7-10 species after 6 months.Enterobacteriaceae was always the predominant family in No.1 infant through the first year,while in No.2 infant the predominant groups included Enterobacteriaceae,Lachnospiraceae,Streptococcacea and Bacteroidaceae.The mean npShannon and Simpson indexes at 4 time points were 1.17,1.29,2.16,2.51 and 0.43,0.40,0.26,0.14 respectively.Conclusion 16S rDNA sequencing could meet the need of studying intestinal microecology in neonates and infants;neonatal and infantile feces contains abounding bacterial genomes;the individual differences exist in intestinal bacterial abundance and composition;the structure of gut bacterial floras trend to complexity and diversity from birth to 1 year old.

intestinal microbiota; sequencing; metagenomics; infant

廣東省深圳市科技計劃項目(201102030)。

馬麗亞，女，主任醫師，碩士，研究方向包括新生兒營養與腸道微生態、新生兒肺損傷。

△通訊作者，E-mail:lugj1111@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.011

A

1672-9455(2015)02-0166-03

2014-05-21

2014-10-30)