核抗體熒光免疫檢測質量控制方法的建立和應用研究

徐吟亞

(武漢市華潤武鋼總醫院檢驗科 430081)

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·臨床研究·

核抗體熒光免疫檢測質量控制方法的建立和應用研究

徐吟亞

(武漢市華潤武鋼總醫院檢驗科 430081)

目的 研究核抗體熒光免疫檢測質量控制的方法及臨床應用。方法 質控品標準的確定，同批號質控品在常規抗核抗體檢測時，與待檢患者的血清標本分別平行檢測9次，計算出各質控品的熒光強度值和變異系數，根據結果作為質控品標準進行分析。質控分析標準的確定，在3種不同熒光強度下，模擬實驗室條件調整熒光圖像的采集時間，分別測定A組300份待檢測血清的熒光強度結果進行比較。針對檢測方法在實施質量分析過程中，主要是通過血清稀釋法以及熒光強度法完成B組(300份)抗核抗體陽性血清標本的具體檢測。其中熒光強度分析法主要指的是對熒光強度進行有效控制，使其有效確保在患者血清平行檢測質控品需要控制的熒光強度的具體范圍之內，檢測血清標本中抗核抗體的滴度。血清稀釋法，抗核抗體陽性的血清標本按照100、1 000、10 000稀釋判斷熒光可見的最高稀釋滴度。結果 質控品標準：同一批號的質控品各9次檢測熒光強度的平均值為106.7±10.2，變異系數的平均值為4.5%。在質控有效控制的范圍之內，常規組、強光組以及弱光組三種情況下測定的熒光強度值差異無統計學意義(P>0.05)。同時采用熒光檢測法和血清稀釋法檢測B組的300份血清標本，其中熒光強度分析法用質控品標準范圍內的熒光強度106.7±10.2，兩種方法測定抗核抗體的滴度符合率較高，均在99%以上。結論 熒光強度分析法在對血清標本進行檢測的過程中表現了非常高的重復性，并且最終的結果也能有效完成測定。

抗核抗體； 熒光強度分析法； 質量控制

自身免疫性疾病(AID)是機體對自身抗原發生的一系列免疫反應的疾病[1]。抗核抗體在自身免疫性疾病的患者血清中可檢出，檢測血清中抗核抗體的水平是診斷自身免疫性疾病的重要手段，同時也可反映在治療過程中療效情況，也是自身免疫性疾病患者預后評估的重要指標[2]。熒光免疫檢測法(IIF)是檢測抗核抗體最早應用于臨床的方法，通常實驗室都會采用熒光免疫檢測法作為篩查試驗。但是當前仍然沒有有效的質量控制體系，在進行實驗室的相關操作方面，都表現了顯著的差異。本次研究主要采用熒光強度分析法針對熒光強度實施數字化處理，分析在進行熒光免疫檢測質量控制的過程中，熒光強度對其產生的影響，以獲得最有效的質量控制方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究對象為收集2013年1～12月來本院就診的抗核抗體陽性的患者血清標本600份，入選標本均為熒光核型且為均質型、斑點型和均質型斑點混合型，每型標本200份；600份標本分為A組、B組兩組，每組標本300份。采用不加附加劑的真空采血管抽取患者靜脈血，低速離心機離心15 min，提取50 μL加入卵育緩沖液，所有標本在-20 ℃環境中冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 儀器為熒光顯微鏡由日本NIKON提供，連接熒光顯微鏡的電腦需安裝數碼成像系統和專用圖像分析軟件，數碼成像系統由美國SPOT32提供。研究試劑為抗核抗體檢測試劑盒為ANA檢測試劑盒，批號為T30222D，并采用同批號的ANA質控品，抗核抗體質控品。整個儀器和試劑操作均嚴格按照儀器和試劑說明書的要求進行。

1.3 研究方法 質控品標準的確定，同批號質控品在常規抗核抗體檢測時，與待檢患者的血清標本分別平行檢測9次，計算出各質控品的熒光強度值和變異系數，根據結果作為質控品熒光強度標準進行分析。質控分析標準的確定，在3種不同熒光強度下，模擬實驗室條件調整熒光圖像的采集時間，分別測定A組300份待檢測血清的熒光強度結果進行比較。常規組：激發濾光片ND4和ND16，曝光時間4 s。強光組：激發濾光片ND16，曝光時間1.5 s。弱光組：激發濾光片ND4、ND8、ND16，曝光時間6 s。檢測方法的質量分析，采用血清稀釋法和熒光強度分析法對B組(300份)抗核抗體陽性血清標本完成相關的檢測。熒光強度分析法，熒光強度控制在與待檢血清平行檢測的質控品的熒光強度范圍內，檢測血清標本中抗核抗體的滴度。在質控的環境下，對比在三種情況下完成測定后熒光強度值的情況，主要分為常規組、強光組以及弱光組，對三組的熒光強度進行系統分析。血清稀釋法，抗核抗體陽性的血清標本按照100、1 000、10 000稀釋判斷熒光可見的最高稀釋滴度。并比較熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合率。

2 結 果

2.1 質控品標準 同一批號的質控品各9次檢測熒光強度的平均值為106.7±10.2，變異系數的平均值為4.5%。

表1 各組熒光強度結果比較±s)

2.2 熒光強度結果的比較 同時采用熒光檢測法和血清稀釋法對B組的血清標本進行相關檢測，在實施熒光強度分析的過程中，主要利用質控品熒光強度值106.7±10.2范圍內的熒光強度，A、B兩組在常規、強光、弱光情況下測定的熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合情況 見表2，結果顯示差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 熒光檢測法和血清稀釋法檢測抗核抗體的滴度符合率

3 討 論

自身免疫性疾病臨床癥狀多種多樣，且癥狀表現復雜，主要為感染性疾病和系統性疾病的相似性，該種疾病在診斷和鑒別上存在許多難點[3]。抗核抗體在血清中的滴度成為診斷自身免疫性疾病的金標準，能否精準地檢測抗核抗體滴度是檢驗學專家面臨的重大問題。

抗核抗體是可識別的細胞核組分，其在某些特定疾病中具有特征性。抗核抗體過去被認為是抗細胞核抗原成分的自身抗體。有報道顯示，抗核抗體通常可以分為下列幾種類型(按細胞內)：抗DNA抗體，具體包括抗單鏈以及抗雙鏈DNA抗體；抗組蛋白抗體以及抗非組蛋白抗體，主要包括抗著絲點抗體、抗ENA抗體以及抗核仁抗體；其余細胞成分的抗體[4]。抗核抗體血清陽性與多種自身免疫性疾病具有相關性[5-6]。

檢測抗核抗體的方法較多，目前實驗室多采用的檢驗模式為先通過熒光免疫法進行篩選實驗，再通過酶聯免疫法和免疫印跡法完成二次的實驗確認[7]。熒光免疫檢測法在檢測抗核抗體中的應用是最早的也是臨床應用最廣泛的，但是由于每個實驗室內的熒光顯微鏡、操作人員技術、結果判定等存在很多差異，會給熒光檢測抗核抗體滴度的準確性帶來許多困難，現急需解決的是建立和完善熒光檢測抗核抗體滴度的質量控制體系，保證熒光免疫檢測法檢測抗核抗體在血清中滴度的結果準確性和可重復性。有國外學者曾經報道，可通過建立熒光強度分析針對熒光圖像完成具體的定量分析，最終能夠有效確定抗核抗體的滴度，在完成數字化處理的過程中站在熒光強度的角度，可以有效將質量控制系統具有的準確性以及重復性排除[8]。實驗室間結果可比性的基礎被判定為質量控制標準，完成實驗室標準的建立后，有效完成實驗室間熒光免疫法的質量控制體系的建立，能夠有效避免實驗室中產生諸多的誤差，將實驗室間結果表現的差異有效縮小，最終成功將抗核抗體血清滴度檢測結果表現出的準確性以及重復性提高[9-10]，從而有效將實驗室之間具有的可比性增強，臨床意義極其廣泛。

本次研究通過質控品熒光強度值標準確定，同批號質控品在實施常規抗核抗體檢測的過程中，同將要實施檢測患者的血清標本完成檢測9次(平行檢測)，最終準確計算出各質控品次檢測熒光強度的平均值為106.7±10.2，變異系數的平均值為4.5%，根據結果作為質控品標準進行分析。結果證實熒光強度分析法在對血清標本進行檢測的過程中，表現了較高的重復性，并且最終獲得的結果表現了準確穩定的特點，利用質控品對熒光強度值進行控制的做法可在實驗室間質量控制中大范圍推廣。使用不同的熒光顯微鏡造成了實驗室間熒光免疫檢測法結果的差異性，本次研究設計了不同熒光顯微鏡的條件，并且采用抗核抗體陽性的血清標本采用血清稀釋法進行對比檢測。本次研究結果證明，雖然實驗室內的熒光顯微鏡在型號配置上存在差異，或者在同一實驗室內熒光顯微鏡的使用壽命、激發光強弱存在差異。但檢驗人員可根據質控品的熒光強度調節具體的曝光時間，在質量控制標準的調整下熒光免疫法測定血清中抗核抗體滴度在不同實驗室的結果應該是相同的。為了進一步驗證質量控制方法的可行性，本次研究采用熒光分析法和血清稀釋法分別檢測抗核抗體血清滴度，結果顯示同時采用熒光檢測法和血清稀釋法對B組血清標本(300份)進行檢測，其中熒光強度分析法用質控品熒光強度值106.7±10.2范圍內的熒光強度，兩種方法測定抗核抗體的滴度符合率較高，均在99%以上。大量的標本檢測證實采用質控品可以得到客觀準確的結果。避免了重復檢查導致過多的浪費資源，與此同時還能夠有效將檢查的經濟費用降低，站在衛生經濟學角度來看，表現了重要的意義。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.048

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1672-9455(2015)02-0245-02

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