促甲狀腺激素釋放激素的電噴霧電離-飛行時間質譜檢測*

夏 冰，朱 輝，黃正旭，劉仲明，王 捷(.廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科，廣州 5000；.廣州禾信分析儀器有限公司，廣州 50530)

?

促甲狀腺激素釋放激素的電噴霧電離-飛行時間質譜檢測*

夏 冰1，朱 輝2，黃正旭2，劉仲明1，王 捷1(1.廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科，廣州 510010；2.廣州禾信分析儀器有限公司，廣州 510530)

目的 探討質譜技術在促甲狀腺激素釋放激素(TRH)檢測中的應用。方法 將樣品用電噴霧電離源在正離子模式下電離，然后置入飛行時間質譜儀檢測。先使用利血平甲醇溶液觀察儀器狀況，再用稀釋好的TRH溶液進樣。結果 TRH產生5個明顯的信號峰，分別位于m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401.000 0、763.234 5，其中m/z 249.074 8為TRH的特征性碎片峰。結論 該研究建立了電噴霧電離-飛行時間質譜技術鑒定TRH的方法，其特異性高及檢測速度快，為下一步研究TRH的定量質譜檢測方法奠定了基礎。

促甲狀腺激素釋放激素； 質譜技術； 電噴霧電離

促甲狀腺激素釋放激素(TRH)是最早被發現的促垂體激素，其相對分子質量較小，僅為1個三肽(pGlu-His-Pro-NH2)，主要產生于下丘腦[1]。近年來研究發現，TRH并不僅表達于腦內，其在肌體內廣泛分布，發揮多種多樣的生理功能。TRH除了調控促甲狀腺激素(TSH)從垂體前葉釋放，還具有抗抑郁、抗癲癇、神經修復、升血壓，抗休克、降血糖、免疫調節、促進頭發生長和變黑等作用[2-4]。在已有的TRH檢測方法中，電化學熒光和高壓液相色譜(HPLC)法的操作十分繁瑣，放射免疫法靈敏度很高但特異性較低[5]。這些方法的缺點限制了在實際工作中的應用，尤其滿足不了臨床檢驗和藥學研究的需要。為此，本研究嘗試建立一種利用質譜儀檢測TRH的新方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 (1)儀器：電噴霧電離源(廣州禾信分析儀器有限公司自主研制)；大氣壓電離飛行時間質譜儀(廣州禾信分析儀器有限公司自主研制，型號APITOF5000)；0.5 mL注射器(Hamliton)；蘭格實驗室用注射泵LSP01-1A；噴針(內徑250 μm、外徑1/16英寸)、噴霧毛細管(內徑100 μm、外徑190 μm)。(2)試劑：促甲狀腺激素釋放激素(Sigma-aldrich,P1319-50 mg)；利血平(阿拉丁試劑上海有限公司，HPLC級]；甲醇(Dikma公司，HPLC級)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司，屈臣氏)。

1.2 方法 首先使用1.7×10-7mol/L利血平甲醇溶液[溶劑為甲醇∶水=80∶20(V/V)]，觀察儀器狀況，然后取100 μL TRH水溶液(5×10-4mol/L)與2 mL溶劑[甲醇∶水=80∶20(V/V)]混勻，獲得濃度為2.5×10-5mol/L的TRH溶液，上樣。第1步使用電噴霧電離源將樣品電離，第2步利用質譜儀進行分析。電噴霧離子化模式:正離子模式;TOF 運行模式:V 模式;分辨率:4 000～5 000;掃描范圍:m/z 80～3 000;離子源電壓3.5 kV；毛細管電壓(Capillary):150 V;毛細管溫度:150 ℃;四極桿接口電壓150 Vpp;調諧溶液:利血平 (m/z 609.273)，30 pg/μL。輔氣為0.5 MPa高純氮氣，進樣流速為7 μL/min。質譜檢測與分析軟件為禾信自主研發的TDC數據采集處理軟件，版本號TDC-V1.1。

2 結 果

2.1 利血平溶液(1.7×10-7mol/L)實驗結果 利血平相對分子質量為608.68，質譜圖上顯示的數據與之相符，表明儀器狀況正常，可用于后續的樣品檢測。見圖1。

圖1 利血平溶液(1.7×10-7 mol/L)實驗

2.2 TRH樣品的檢測結果 將稀釋好的TRH溶液(2.5×10-5mol/L)進樣，一共產生5個明顯的信號峰，分別位于m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401.000 0、763.234 5。見圖2。

圖2 TRH樣品的檢測結果

3 討 論

1970年Guillemin小組首次報道了TRH這一參與調節垂體激素釋放的物質，但后來的相關研究表明，該三肽的生理功能遠不止于此，而且在某些疾病時其含量會發生變化。這些新發現要求建立一種檢測TRH的特異而敏感的方法。目前已有的檢測方法均存在各種缺陷，如放射免疫測定法由于僅針對免疫表位從而缺乏分子的特異性，導致定性與定量的不準確；熒光定量PCR技術則由于mRNA水平不總是反映實際的基因表達量而造成檢測結果也不準確，因此有必要研發更高特異性的定性與定量手段檢測TRH。

質譜技術被公認為是一種檢測和分析蛋白質及小分子的重要方法。有學者研究報道，可用質譜法檢測的生物活性多肽包括視紫質、C-反應蛋白、β-內啡肽等[6-8]。本研究建立了一種基于質譜的快速而敏感的TRH檢測方法，本實驗數據顯示，m/z 249.074 8為TRH電離后產生的特異性碎片峰，相當于N端焦谷氨酸-組氨酸二肽，與Chambery等[9]用質譜方法檢測的結果一致。TRH的相對分子質量為362.38，因此其分子離子峰(M+H+)理論上應在m/z 363.38。而本組實驗的測定值為363.138 2，與理論值略有差異，可能是由于樣品濃度過高、相應的峰過于飽和導致實驗誤差。m/z 385.111 9為TRH與Na+(MW=23)絡合形成的峰(M+Na+)，m/z 401.000 0為TRH與K+(MW=39)絡合形成的峰(M+K+)，m/z 763.234 5為2個TRH分子與1個K+絡合形成的峰(2M+K+)。圖譜中這些Na+、K+的摻入可能是由于原液在玻璃瓶中浸泡時間過長所導致。

綜上所述，本研究方法用于檢測TRH具有高度的特異性，而且操作簡便，耗時少，從上樣到取得結果僅需數分鐘。下一步本組將研究TRH定量分析的質譜技術，最終達到檢測生物體液和組織TRH含量的目標。

[1]夏冰,王鋼,王捷.促甲狀腺激素釋放激素的廣泛生物學作用[J].實用醫學雜志,2014,30(22)：105-107.

[2]Asai H,Watanabe Y,Yamauchi-Kohno R,et al.Reversal of hemorrhagic shock in rats using the metabolically stable thyrotropin-releasing hormone analog taltirelin hydrate[J].J Recept Signal Transduct Res，2011,31(6):416-422.

[3]Luo L,Luo JZ,Jackson I.Tripeptide amide L-pyroglutamyl-histidyl-L-prolineamide (L-PHP-thyrotropin-releasing hormone,TRH) promotes insulin-producing cell proliferation[J].Curr Aging Sci，2013,6(1):8-13.

[4]Gáspár E,Nguyen KT,Hardenbicker C,et al.Thyrotropin-releasing hormone selectively stimulates human hair follicle pigmentation[J].J Invest Dermatol，2011,131(12):2368-2377.

[5]Nillni EA,Vaslet C,Harris M,et al.Leptin regulates prothyrotropin-releasing hormone biosynthesis:evidence for direct and indirect pathways[J].J Biol Chem,2000,275(46):36124-36133.

[6]Barnidge DR,Goodmanson MK,Klee GG,et al.Absolute quantification of the model biomarker prostate-specific antigen in serum by LC-Ms/MS using protein cleavage and isotope dilution mass spectrometry[J].J Proteome Res，2004,3(3):644-652.

[7]Kuhn E,Wu J,Karl J,et al.Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and13C-labeled peptide standards[J].Proteomics，2004,4(4):1175-1186.

[8]Han SH,Kim JS,Lee Y,et al.Both targeted mass spectrometry and flow sorting analysis methods detected the decreased serum apolipoprotein E level in Alzheimer′s disease patients[J].Mol Cell Proteomics，2014,13(2):407-419.

[9]Chambery A,Severino V,Di Maro A,et al.Quantification of thyrotropin-releasing hormone by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J].Amino Acids，2010,38(4):1031-1041.

Detection of thyrotropin-releasing hormone by electrospray ionization-time of flight mass spectrometry*

XIABing1,ZHUHui2,HUANGZheng-xu2,LIUZhong-ming1,WANGJie1

(1.DepartmentofMedicalResearch,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou,Guangdong510010,China;2.GuangzhouHexinAnalyticalInstrumentCompany,Guangzhou,Guangdong510530,China)

Objective To explore the application of mass spectrometry in the detection of thyrotropin-releasing hormone(TRH).Methods The sample was ionizated by electrospray source operating in positive-ion mode，and then was analyzed by a time of flight mass spectrometer.After we were sure that the equipment condition was fine by injecting reserpine first,we injected TRH to the system.Results TRH produced 5 peaks,which were at m/z 249.074 8、363.138 2、385.111 9、401和763.234 5 respectively,and the fragment at m/z 249.074 8 was a specific TRH product.Conclusion In this study we have established a method of detection of TRH by electrospray ionization-time of flight mass spectrometry,which has high sensitivity and high speed,so it has laid the foundation for our future study on quantification of TRH by mass spectrometry.

thyrotropin-releasing hormone; mass spectrometry; electrospray ionization

廣東省科技計劃項目(2013B021800052)。

夏冰，女，博士，副主任醫師，主要從事基礎醫學研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.003

A

1672-9455(2015)11-1504-02

2014-12-15

2015-02-18)