大黃素對(duì)大鼠肝臟毒性的實(shí)驗(yàn)研究*

閔曉春，韓宗儒，張曉雨，姚 勤，沈啟剛(上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院感染科 200018)

?

大黃素對(duì)大鼠肝臟毒性的實(shí)驗(yàn)研究*

閔曉春，韓宗儒△，張曉雨，姚 勤，沈啟剛(上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院感染科 200018)

目的 探討不同劑量的大黃素對(duì)大鼠肝臟的損害程度。方法 給予SD大鼠不同劑量的大黃素灌胃(依次為3、6、12 mg/(kg·g)，每日1次，連續(xù)2個(gè)月，分別于用藥后20、40、60 d觀察其一般狀況、體質(zhì)量，檢測(cè)大鼠血常規(guī)、生化指標(biāo)及肝臟組織病理情況。結(jié)果 大鼠各劑量組與對(duì)照組間一般狀況及體質(zhì)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各劑量組與對(duì)照組間血常規(guī)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝臟病理顯示各組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈未見擴(kuò)張，匯管區(qū)無增生，未見炎性細(xì)胞浸潤，部分劑量組大鼠肝細(xì)胞可見脂肪變性及細(xì)胞水腫，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 大黃素長期、大劑量灌胃對(duì)大鼠無明顯肝損害。

何首烏； 大黃素； 肝損害； 毒性實(shí)驗(yàn)

何首烏是常用補(bǔ)益中藥，近年來有關(guān)何首烏引起肝臟損傷的不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道。有研究表明，何首烏對(duì)肝臟的毒性可能與其中的蒽醌類物質(zhì)有關(guān)，而大黃素是主要的蒽醌化合物[1]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，隨著濃度增高、作用時(shí)間延長，大黃素對(duì)健康者肝細(xì)胞有明顯的抑制作用[2]。目前動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)少有報(bào)道，本研究將健康遠(yuǎn)交群(SD)大鼠作為研究對(duì)象，檢測(cè)其攝入不同劑量大黃素后的狀況及相關(guān)指標(biāo)，以進(jìn)一步探討大黃素對(duì)肝臟的損傷情況及其量-毒規(guī)律，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠(120～140 g)140只，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為SCXK(滬)2008001628882。動(dòng)物飼養(yǎng)于上海海軍醫(yī)學(xué)研究所，許可證號(hào)為SYXK(滬)2012-0033。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，雌雄分開，每籠5只。

1.2 儀器與試劑 美國雅培AEROSET全自動(dòng)生化分析儀；法國ABX pentra60 血細(xì)胞分析儀；德國Zeiss公司MICROM-340M切片機(jī)；英國Shandon 公司Hypereonler XP 型組織脫水機(jī)。大黃素、羧甲基纖維素鈉粉末購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司；肝功能檢測(cè)試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 分組及藥物劑量 將大鼠隨機(jī)分成5組，每組27只，為大黃素大劑量[12 mg/(kg·g)]、中劑量[6 mg/(kg·g)]、小劑量[3 mg/(kg·g)]組、溶劑對(duì)照組(等體積羧甲基纖維素鈉溶液)、空白對(duì)照組(等體積蒸餾水)，3個(gè)水平劑量組，分別是臨床用藥的10、20、40倍；每日灌胃給藥1次(1 mL/100 g大鼠體質(zhì)量)，每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量，連續(xù)給藥60 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 (1)一般狀況觀察：每周稱體質(zhì)量1次，每天觀察用藥后大鼠精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食、排泄物、活動(dòng)等情況。(2)血常規(guī)及肝功能檢測(cè)：分別于用藥后20、40、60 d采集大鼠血液，檢測(cè)其血常規(guī)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)。(3)病理檢測(cè)：分別于給藥后20、40、60 d處死部分大鼠，摘取肝臟，觀察其形態(tài)、顏色、質(zhì)地,并進(jìn)行肝臟組織病理檢查。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 用藥期間，大鼠進(jìn)食、排泄物、活動(dòng)情況正常，毛色無異常變化，各組無病死例數(shù)。

2.2 大鼠體質(zhì)量 雄、雌大鼠在給藥20、40、60 d時(shí)體質(zhì)量均在正常范圍，各組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表1、2。

表1 各組雄性大鼠給藥60 d體質(zhì)量變化±s)

表2 各組雌性大鼠給藥60 d體質(zhì)量變化±s)

2.3 血常規(guī)檢測(cè) 大鼠在給藥20、40 d時(shí)血常規(guī)各指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，各劑量組與對(duì)照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥60 d時(shí)血常規(guī)各指標(biāo)也在正常范圍內(nèi)，各劑量組與對(duì)照組之間，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 肝功能檢測(cè) 大鼠在給藥20、40 d時(shí)ALT、AST、TBIL各劑量組與對(duì)照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥60 d時(shí)各劑量組與對(duì)照組之間比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 大鼠給藥60 d時(shí)血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較±s)

表4 大鼠給藥60 d時(shí)肝功能檢測(cè)結(jié)果比較

2.5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) (1)肉眼觀察：對(duì)照組及各劑量組大鼠肝臟，其形態(tài)正常，質(zhì)地柔軟，紅潤光澤，未見結(jié)節(jié)、包塊、囊腫等。(2)HE染色后光鏡下觀察：20、40 d時(shí)，對(duì)照組及各劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見腫脹、壞死，中央靜脈未見擴(kuò)張，匯管區(qū)無增生，未見炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞可見小泡性脂肪變性，40 d時(shí)部分肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度濁腫，但各組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；60 d時(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞邊界清晰，中央靜脈未見擴(kuò)張，匯管區(qū)無增生，未見炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞可見大、小泡性脂肪變性，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)輕、中度水樣變性，但各組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(3)MASSON染色后光鏡下觀察：對(duì)照組及各劑量組肝小葉及匯管區(qū)未見異常纖維增生。見圖1。

A:空白對(duì)照組;B:溶劑對(duì)照組;C:小劑量組;D:中劑量組;E:大劑量組。

3 討 論

孫震曉和張力[3]研究結(jié)果提示，何首烏中可能存在少量對(duì)肝細(xì)胞有直接毒性或經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化的有毒化學(xué)成分，臨床癥狀與急性黃疸型肝炎相似。現(xiàn)代藥理研究表明，何首烏主要含有蒽醌類化合物、二苯乙烯苷、磷脂等成分。目前的研究未發(fā)現(xiàn)何首烏肝臟毒性與磷脂類及二苯乙烯苷成分有關(guān)。有研究表明何首烏肝臟毒性與蒽醌類物質(zhì)有關(guān)，而大黃素是其中主要的蒽醌化合物[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大黃素存在低劑量促進(jìn)肝細(xì)胞生長、高劑量抑制肝細(xì)胞生長的特性，說明大黃素對(duì)肝細(xì)胞的作用具有雙重性[4]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，隨著作用時(shí)間的延長、濃度的增高，大黃素對(duì)健康者肝細(xì)胞L02有明顯的抑制作用[2]。臨床上何首烏引起的肝損害表現(xiàn)為累積效應(yīng)，當(dāng)大劑量短時(shí)間或小劑量長時(shí)間服用何首烏均可能導(dǎo)致急性肝損害[1]。體內(nèi)大黃素濃度累計(jì)達(dá)到一定閾值，就有可能引起肝臟損傷，如果患者存在相關(guān)代謝酶缺失、功能障礙或敏感體質(zhì)就更容易造成[1]。目前的研究表明，藥物性肝損傷的過程是多因素參與的復(fù)雜過程，其中自由基和脂質(zhì)過氧化物在肝損傷中起著重要作用，經(jīng)藥物代謝酶產(chǎn)生自由基等毒性產(chǎn)物，引發(fā)細(xì)胞膜過氧化物及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死、凋亡等。其次為機(jī)體對(duì)藥物的變態(tài)反應(yīng)，藥物劑量與疾病嚴(yán)重程度之間無肯定聯(lián)系。然后可能與遺傳因素有關(guān)，藥物通過誘導(dǎo)或抑制肝P450酶系，從而導(dǎo)致治療濃度下降或藥物代謝減少，使毒性代謝產(chǎn)物增強(qiáng)或直接延長藥物的作用而引起不良反應(yīng)。目前臨床提示何首烏引起的肝損害與用藥劑量成一定的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)藥物的變態(tài)反應(yīng)，并且有一定的家族性發(fā)病傾向，結(jié)合相關(guān)研究[1,5]，初步推測(cè)是何首烏中的蒽醌類化合物或其毒性產(chǎn)物對(duì)肝臟的直接損害，并可能對(duì)肝細(xì)胞P450酶系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響[6-7]。

本研究以不同劑量的大黃素給大鼠灌胃用藥(分3個(gè)水平的劑量組，以制首烏成人用藥每日30 g計(jì)[8]，經(jīng)折算分別相當(dāng)于臨床用藥的10、20、40倍)，觀察大黃素對(duì)大鼠肝臟的損傷程度。本組一般毒性觀察結(jié)果顯示，在整個(gè)用藥期間，大鼠進(jìn)食、活動(dòng)正常，毛色無異常變化，各組無動(dòng)物病死例數(shù)。與對(duì)照組比較，大鼠各劑量組之間體質(zhì)量在用藥各個(gè)階段點(diǎn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示大黃素連續(xù)灌胃給藥無明顯系統(tǒng)性毒性。血常規(guī)多次檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝功能檢測(cè)表明，與對(duì)照組比較，不同劑量大黃素用藥的大鼠血清ALT、AST、TBIL水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示大黃素對(duì)大鼠肝功能無明顯損傷。肝臟病理結(jié)果顯示，對(duì)照組及各劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞未見壞死，中央靜脈未見擴(kuò)張，匯管區(qū)無增生，未見炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞可見大小泡性脂肪變性及細(xì)胞水腫，但各組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與ALT、AST水平結(jié)果一致，顯示長期較大劑量大黃素用藥對(duì)大鼠肝臟無明顯損害。

綜上所述，長期較大劑量大黃素灌胃用藥未見明顯肝損害，符合大黃素對(duì)肝細(xì)胞雙重作用的特性[4]。有關(guān)研究報(bào)道小劑量大黃素可以對(duì)四氯化碳(CCl4)等引起的大鼠肝臟損傷具有保護(hù)作用，可直接抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成。還有實(shí)驗(yàn)表明，大鼠體內(nèi)的CCl4可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450酶活性及超微結(jié)構(gòu)的改變，而小劑量范圍內(nèi)的大黃素可逆轉(zhuǎn)這種改變[9-10]。盡管體外實(shí)驗(yàn)提示隨著作用時(shí)間延長、濃度增高，大黃素對(duì)健康者肝細(xì)胞有明顯抑制作用，但在實(shí)際應(yīng)用中大黃素是否對(duì)動(dòng)物肝細(xì)胞有損傷尚不明確，本研究結(jié)果提示目前臨床常用劑量的使用較安全，至于劑量用多大、持續(xù)時(shí)間將對(duì)肝臟造成損害尚不能確定。關(guān)于其引發(fā)肝細(xì)胞損傷的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]方紅玫,朱廷焱.何首烏有效成分、毒性作用和相關(guān)研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志,2010,37(4):283-286．

[2]孫向紅,孫玉維,李紅,等.何首烏主要成分大黃素、大黃酸和二苯乙烯苷對(duì)肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(11):1315-1319．

[3]孫震曉,張力.何首烏及其制劑相關(guān)肝損害國內(nèi)文獻(xiàn)回顧與分析[J].藥物不良反應(yīng)雜志,2010,12(1):26-30．

[4]張瑞晨,劉斌,孫震曉,等.何首烏提取物對(duì)人正常肝細(xì)胞L02周期阻滯及凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào),2010,8(6):554-561．

[5]衛(wèi)培峰,黨艷麗,焦晨莉.何首烏不同成分與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J].陜西中醫(yī),2009,30(2):238-239．

[6]Bhadauria M,Shrivastava S,Nirala SK,et al.Emodin reverses CCl4 induced hepatic cytochrome P450(CYP)enzymatic and ultrastructuralchanges.The in vivo vidence[J].Hepatol Res,2009,39(11):290-300．

[7]胡錫琴,林飛,李婭琳.何首烏、制何首烏與茯苓配伍對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450的影響[J].陜西中醫(yī),2009,30(2):240-241．

[8]田代華.實(shí)用中藥辭典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:952-954．

[9]展玉濤,李定國,沈禮勇,等.大黃素抗肝纖維化的細(xì)胞學(xué)機(jī)制[J].臨床肝膽病雜志,2006,22(1):43-44．

[10]張欣,黨雙鎖,程延安,等.大黃素和黃芪多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,30(4):502-505．

Experimental study on the tocicology of emodin in polygonum multiflorum to the rats′liver*

MINXiao-chun,HANZong-ru△,ZHANGXiao-yu,YAOQin,SHENQi-gan

(DepartmentofInfectiousDisease,JiadingDistrictCentralHospital,Shanghai201800,China)

Objective To study different doses of emodin injuring effects on rats′liver.Methods The SD rats were infused with emodin,different dosages [3,6,12 mg/(kg·g)]once a day,60 days.The general condition of rats and weight were observed.The rats′blood samples were taken on the 20 d,40 d and 60 d for hematology and liver functional examination.Meanwile,liver tissue and liver homogenate were taken for histopathology examination.Results Compared with the control groups,the experimental groups which were given different dosages have no significant difference on the general condition,weight,indexes of hematology and liver function．Pathologic examination displayed that the structure of hepatic lobule was complete without expansion of central vein.There are no hyperplasia and infiltration of inflammatory cells in the portal area.Hepatic steatosis and edema is shown in the part of experimental groups,but show no statistical significance.Conclusion Long term use of high dose emodin for intragastric administration does no injure to SD rats′ liver.

polygonum multiflorum； emodin； liver injury； toxicity test

上海市衛(wèi)生局資助項(xiàng)目(20114052)。

閔曉春，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事感染性疾病的診治研究。

△通訊作者，E-mail：zqmxcaexshq@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.011

A

1672-9455(2015)11-1522-03

2014-12-20

2015-02-18)