耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌的質(zhì)粒基因研究*

劉鮮花，羅史科，祝玲玲，呂東月(.廣東省深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 5808；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 5804)

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耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌的質(zhì)粒基因研究*

劉鮮花1，羅史科1，祝玲玲1，呂東月2(1.廣東省深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 518081；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518104)

目的 研究耐喹諾酮類藥物銅綠假單胞菌(PA)的質(zhì)粒基因，并分析其耐藥機制。方法 臨床分離的耐喹諾酮類藥物的PA 100株，采用PCR法檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr，并對陽性結(jié)果進行測序分析。結(jié)果 100株P(guān)A中檢測出含有qnrA基因的菌株34株(34%)；qnrB基因79株(79%)；qnrD基因14株(14%)；qnrS基因8株(8%)；aac(6′)-Ib-cr基因55株(55%)；未檢測出qnrC和qepA基因的菌株。結(jié)論 質(zhì)粒攜帶的qnrA、qnrB/aac(6′)-Ib-cr耐藥基因是PA耐喹諾酮類藥物的主要機制。

喹諾酮類藥物； 銅綠假單胞菌； 質(zhì)粒； 基因

喹諾酮類藥物是臨床上常用的抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶的抗菌藥物，銅綠假單胞菌(PA)是一種最常見的引起醫(yī)院感染的革蘭陰性桿菌[1]。隨著喹諾酮類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，PA耐藥株不斷增加，造成臨床對其感染治療和控制變得困難[2]。PA對喹諾酮類藥物的耐藥機制復(fù)雜，其中質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(PMQR)包括qnr、qepA、oqxAB、aac(6′)-Ib-cr，其耐藥新機制近年來倍受關(guān)注[3-5]。現(xiàn)對100株P(guān)A進行檢測，探討耐藥機制。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 該院自2012年2月至2014年6月門診及住院患者的100株耐喹諾酮類藥物的PA，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩＞攴蛛x自痰液、分泌物、血液、胸水和膿液等，剔除同一患者來源的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸埃希菌ATCC 25922，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑 EPS3501XL電泳儀，美國Pharmacia公司；5810R型高速離心機，德國Eppendorf公司；PCR擴增儀，美國MJ Research公司；310基因分析儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；FUSION Fx7凝膠成像系統(tǒng)，法國VILBER公司；細菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA提取 從血瓊脂平板上選取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃，190 r/min，振蕩孵育過夜。吸取1 mL菌液于離心管內(nèi)，12 000 r/min，離心5 min，去除上清液。加入PBS 1 mL，吹打沉淀細菌后，12 000 r/min，離心5 min，棄上清液。再加入超純水500 μL，吹打混勻后置于100 ℃沸水浴5 min，12 000 r/min，離心5 min，獲取上清液即DNA提取液分裝于離心管中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR引物的設(shè)計與合成 采用PCR檢測的qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr基因引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。見表1。

1.3.3 PCR擴增及產(chǎn)物電泳 引物各0.5 μmol/L，dNTPs各200 μmol/L，加入Taq DNA聚合酶2.5 U，MgCl22 mmol/L，模板液5 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)：(1)qnrB、qnrD、qnrS、qepA基因：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 50 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)，72 ℃延長至2 min。(2)qnrA、qnrC、aac(6′)-Ib-cr基因：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延長至5 min。PCR產(chǎn)物10 μL與2 μL上樣緩沖液混勻加入2%瓊脂糖凝膠，110 V電泳30 min后置入凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 核酸序列分析 擴增后的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送深圳華大基因生物技術(shù)有限公司進行序列測定，檢測結(jié)果使用DNAStar軟件進行校正并與GenBank核酸(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR基因擴增產(chǎn)物 利用PCR方法檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr，擴增產(chǎn)物大小分別為516 bp、469 bp、447 bp、664 bp、417 bp、596 bp、482 bp。見圖1。

表1 PCR引物序列

注：M表示標記物；1表示qnrS；2表示qnrB；3表示aac(6′)-Ib-cr；4表示qnrC；5表示qnrA；6表示qepA；7表示qnrD。

2.2 質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR基因檢測結(jié)果 100株耐喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星)的PA中檢測出含有qnrA基因的菌株34株(34%)；qnrB基因79株(79%)；qnrD基因14株(14%)；qnrS基因8株(8%)；aac(6′)-Ib-cr基因55株(55%)；未檢測出含qnrC和qepA基因的菌株。見表2。

表2 100株質(zhì)粒介導(dǎo)的PMQR基因檢測結(jié)果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

3 討 論

抗菌藥物大量、長期使用，致使細菌耐藥性增強，已經(jīng)成為感染性疾病治療的一大難題。PA廣泛存在于機體的皮膚和呼吸道等，是臨床上最常見的條件致病菌，引起肺炎、泌尿感染、敗血癥等疾病[6]。喹諾酮類藥物通過抑制細菌的拓撲異構(gòu)酶，阻斷DNA復(fù)制從而達到抗菌作用，環(huán)丙沙星是臨床治療PA最有效的藥物之一，但隨著其廣泛使用，耐環(huán)丙沙星的PA已經(jīng)達到40%以上，嚴重影響臨床治療效果[7-8]。

PA對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要途徑：(1)主動外排和膜屏障，導(dǎo)致藥物無法達到作用靶點，使得其對多種抗菌藥物獲得耐藥。(2)細菌編碼的喹諾酮類藥物的Ⅳ類拓撲異構(gòu)酶和DNA旋轉(zhuǎn)酶的基因突變，致使藥物不能與酶-DNA復(fù)合物穩(wěn)定結(jié)合導(dǎo)致抗菌作用無效。(3)細菌生物膜的形成，其有極強的抵抗作用和耐藥性，感染了細菌生物膜的組織即使治療藥物的劑量加倍也難以治愈[9]。染色體介導(dǎo)和質(zhì)粒介導(dǎo)是PA對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制。pMG252是最早報道的質(zhì)粒，可使細菌對喹諾酮類藥物的耐藥水平提高，Martinez等將該質(zhì)粒命名為qar(quinolone resistance)，后改為qnrA1。此后又發(fā)現(xiàn)了qnrB、qnrC、qnrD、qnrS 4種基因亞基。aac(6′)-Ib-cr最早分離于大腸埃希菌中，是一類編碼氨基糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶而使得細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的基因。aac(6′)-Ib-crr其編碼蛋白發(fā)生Trp 102-Arg、Asp179-Tyr突變而產(chǎn)生介導(dǎo)環(huán)丙沙星耐藥的新特性而命名，其主要對環(huán)丙沙星哌嗪環(huán)上氨基乙酰化作用而介導(dǎo)低水平耐藥[10]。

目前有關(guān)喹諾酮類抗菌藥物的機制研究，大多數(shù)學(xué)者認為是拓撲異構(gòu)酶的基因退變而導(dǎo)致細菌耐藥，對質(zhì)粒的作用僅表現(xiàn)低水平耐藥。PMQR基因的研究大部分是腸桿菌(如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌)，有PA的研究非常少。本研究從100株耐喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星)的PA中未檢測出qnrC和qepA基因，檢出含有qnrA、qnrB、qnrD、qnrS/aac(6′)-Ib-cr基因的菌株,陽性率分別為34%、79%、14%、8%、55%，其中qnrA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr具有較高的攜帶率，表明其在耐藥機制中發(fā)揮重要的作用。

[1]明德松，鄧勇.國內(nèi)銅綠假單胞茵對喹諾酮類藥物耐藥機制的Meta分析[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2013,13(10):1215-1218.

[2]Willcox MD.Review of resistance of ocular isolates of Pseudomonas aeruginosa and staphylococci from keratitis to eiprofloxacin,gentanficin and cephalosporins[J].Clin Exp Optom,2011,94(2):161-168.

[3]陳樹林,陳利達,陳茶，等.銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥的分子機制研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，24(8):899-904.

[4]郭小慧，張莉萍．銅綠假單胞菌耐藥機制的最新研究進展[J]．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(9)：968-971.

[5]賀婷,江濤.銅綠假單胞菌耐藥相關(guān)基因研究進展[J].國際呼吸雜志，2013,33(5)：393-396.

[6]Stove CK,Pham QX,Erwin AL,et al.Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1 an opportumistic pathogen[J].Nature,2000,11(4):406-409.

[7]邱紅，胡禮儀，彭濤，等．grrA和Parc介導(dǎo)的銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星耐藥機制研究[J]．國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(8)：831-833．

[8]Dubois V,Arpin C.Nosocoomial outbreak due to a multiresistant strain of Psuedomonas aeruginosa:efficacy of cefepime-amikacin theraoy and analysis of β-lactamase resistance[J].Clin Microbiol,2002,39(11):2072-2074.

[9]Cavaco LM,Hasman H,Xia S,et al.A novel gene conferring transferable quinolone resistance in Salmonella enterica serovar Kentacky and Bovismorbificans strains of human origin[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(12):603-608.

[10]蔣崗，徐霖，關(guān)琳琳，等.銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2013,13(7):813-816.

Study of plasmid-mediated quinolones antibacterial in pseudomonas aeruginosa*

LIUXian-hua1,LUOShi-ke1,ZHULing-ling1,LUDong-yue2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YantianHospital,Shenzhen,Guangdong518081,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShajingAffiliatedHospitalofGuangzhouMedical,Shenzhen,Guangdong518104,China)

Objective To study the quinolones resistance plasmid genes in pseudomonas aeruginosa and analyze its mechanism.Methods pseudomonas aeruginosa samples were collected for the detection of qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,qnrS,qepA and aac(6′)-Ib-cr gene using PCR,then the positive samples were detected by sequence analysis.Results qnrC and qepA gene were not detected in strains resistance to Ciprofloxacin.the positive rate of qnrA,qnrB,qnrD,qnrS,aac(6′)-Ib-cr gene is 34%,79%,14%,8%,55% respectively.Conclusion plasmid with qnrA,qnrB,aac(6′)-Ib-cr gene is the main mechanism in pseudomonas aeruginosa to quinolones antibacterial.

quinolones antibacterial; pseudomonas aeruginosa; plasmid; gene

深圳市鹽田區(qū)科技計劃資助項目(201211)。

劉鮮花，女，本科，主管技師，主要從事微生物檢驗研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.014

A

1672-9455(2015)11-1530-02

2014-12-25

2015-02-12)