衣殼蛋白和甲基轉移酶對戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王躍榮(上海中醫藥大學附屬市中醫醫院檢驗科，上海 200071)

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衣殼蛋白和甲基轉移酶對戊型肝炎病毒的基因分型

胡玲玲，王躍榮△(上海中醫藥大學附屬市中醫醫院檢驗科，上海 200071)

目的 探討人戊型肝炎病毒(HEV)的部分編碼區序列能否作為其基因組分型的依據。方法 從GenBank中查找并下載全基因組測序完整的能感染人類的HEV基因組及蛋白序列共35株，用Clustal W程序對35株HEV全序列以及部分編碼區序列進行多序列比對，并用treev 32繪制基因進化樹，研究其進化關系。結果 HEV的基因組全長7.5 kb；而衣殼蛋白和甲基轉移酶的編碼序列分別為1 982 bp和545 bp，這2種蛋白的多序列比對和進化分析結果與完整基因組的分型結果相符。結論 衣殼蛋白和甲基轉移酶可作為HEV的分型依據，且是一種更簡便、快捷的方法。

戊型肝炎病毒； 基因型； 衣殼蛋白； 甲基轉移酶

戊型肝炎病毒(HEV)引起的戊型肝炎是一種經糞-口途徑傳播的傳染病，是發展中國家重要的公共衛生問題之一[1-2]。孕婦患病率較高，且病情嚴重，常出現流產、死胎或急性肝壞死[3]。HEV是單股正鏈RNA病毒，有3個開放讀碼框(ORF)[4]。ORF1主要編碼5種非結構蛋白：甲基轉移酶、木瓜樣半胱氨酸蛋白酶、多聚脯氨酸鉸鏈、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶；ORF2為病毒的主要結構蛋白編碼區，主要編碼衣殼蛋白。

戊型肝炎的診斷和疫苗的研制均涉及HEV分型，有報道顯示戊型肝炎發病的嚴重性及預后與HEV基因類型相關。目前能感染人類的HEV分為4個基因型，主要是根據各HEV分離株全基因序列的核苷酸同源性，由于采用了全部的基因信息，因此結果最為準確[5]。但全基因測序費時費力，且序列較長，比對較困難，甚至無法進行，所以多數研究人員致力于設計出更為簡便和有效的分型方法。國內外研究者大多選取HEV部分基因序列替代全基因序列進行基因分型。本研究選取HEV部分基因序列探討能否替代全基因序列進行基因分型，報道如下。

1 資料與方法

1.1 HEV參考株 Chi-XJ1株(NC_001434)為基因型4型，是GenBank中測序最全且準確的?；?型只有墨西哥分離株(MEX-14)的全基因序列收錄在GenBank中，在此不列入研究，主要對基因1、3、4型進行探討。

1.2 多序列比對和系統進化分析 多序列比對是序列分析的基礎，有時用來區分1組序列之間的差異,但其主要用于描述1組序列之間的相似性關系，生成系統樹圖，將序列按相似性分組。目前使用最廣泛的多序列比對程序是Clustal W。本組使用Clustal W程序對35株HEV全序列進行多序列比對，用treev 32繪制基因進化樹，研究其進化關系。

1.3 核苷酸序列比對和系統進化分析 從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank中查找并下載全基因組測序完整的、能感染人HEV基因組及蛋白序列共35株，其中1型有12株，3型有9株，4型有14株。利用Clustal W和 treev 32軟件對HEV的全基因組以及HEV編碼的蛋白質基因片段分別進行多序列比對，進行基因進化樹和同源性分析。

2 結 果

2.1 35株HEV的全基因組多序列比對結果 將測序完整的35株HEV基因組用Clustal W進行多序列比對，treev 32進行進化樹分析。如不考慮測序誤差，圖1顯示全基因序列的多序列比對將35株HEV分成3個基因型，每株病毒的分型結果都與GenBank一致?；?型的HEV集中在右下支，基因3型集中在左下支，而基因4型集中在上支，提示HEV全基因組的多序列比對及進化樹分析可用于基因分型。見圖1。

2.2 衣殼蛋白的基因序列對HEV的基因分型 本組從GenBank中查找的35株人HEV幾乎都有其編碼的核衣殼蛋白序列(除D、Chi-HB)。將編碼這些衣殼蛋白的基因序列用Clustal W進行比對，并用treev 32進行進化分析。圖2和圖1進行比較，提示編碼HEV病毒衣殼蛋白的基因序列和全基因序列的多序列比對，在HEV的分型取得了一致的結果，同時也將35株HEV分成了3個基因型，且每株病毒都被正確地歸類到該基因型中。但比對的基因序列長度，前者只有2 kb左右，而后者卻有7.5 kb，極大地節約了測序成本，也減少了操作時間，表明HEV的衣殼蛋白的基因序列也可作為HEV的分型依據。見圖2。

圖1 35株HEV全基因組進化樹

圖2 33株HEV衣殼蛋白基因序列進化樹

圖3 35株HEV甲基轉移酶基因序列進化樹

2.3 甲基轉移酶的基因序列可用于HEV的基因分型 甲基轉移酶是HEV的非結構蛋白之一，與病毒RNA復制相關，長度僅為545 bp。本組用同樣的方法將甲基轉移酶的基因序列也進行多序列比對和系統進化樹分析，顯示編碼HEV病毒甲基轉移酶的基因序列和全基因序列的多序列比對在HEV的分型也取得了一致結果，均將35株HEV準確地分成了3個基因型，雖然各個基因型內部的進化樹有所不同，但每株病毒都被正確地歸類到該基因型中，所以可以把甲基轉移酶也作為HEV的分型依據。見圖3。

3 討 論

我國是戊型肝炎的主要流行區之一，自20世紀50年代被首次報道以來，由于實驗室檢測技術的局限，其發病率和感染率一直被低估。近幾年來，戊型肝炎患者例數逐漸上升，嚴重危害人們的健康，降低其生活和工作質量，因此對HEV的研究尤其重要[6-7]。

免疫學診斷是目前我國臨床戊型肝炎診斷的主要手段，用HEV重組抗原檢測HEV抗體是主要方法之一，但受包被抗原的特異性和敏感性限制；也可同時進行HEV RNA的PCR檢測，但不同HEV基因型常對引物有一定的選擇性，不易找到具有普遍、通用性的高靈敏引物，目前應用較多的是HEV ORF2區域內150 nt片段。

戊型肝炎發病的嚴重性還受到HEV基因類型的影響，雖然其一直被認為是急性自限性疾病，一般無慢性病患者。但已有的研究卻發現一些服用免疫抑制劑的器官移植患者、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者等出現慢性HEV感染，并被確診為基因3型HEV感染[8-11]。而HEV的持續感染在基因1、2型感染者還未見報道。也有研究顯示感染HEV基因4型感染患者比3型患者發病更嚴重[12]。因此，為了可以更好地判斷戊型肝炎的病情及預后，需快速、準確地對HEV進行基因分型。

傳統的HEV分型是基于全基因序列的比對分析，雖然準確性較高，一旦序列比較長，待比較的序列數目較多時，比對時間延長，甚至無法進行，改進的方法是可以選取全序列的某一片段來替代全基因組序列進行比對。本研究從GenBank中下載35株測序完整的、能感染人類的HEV基因組及蛋白序列，其中1型有12株，3型有9株，4型有14株(由于基因2型只有墨西哥分離株MEX-14的全基因序列收錄在GenBank中，在此沒有列入研究)。

本組對35株HEV的衣殼蛋白和甲基轉移酶分別用Clustal W進行多序列比對，并用treev 32繪制進化樹，描述各病毒株之間的親緣關系，發現結果與全基因序列的比對結果一致，皆可分為1、3、4型，雖然各型內的進化關系稍有不同，但基因型的分類與GenBank中的報道一致。HEV基因組全長為7.5 kb，與其相比，本組選取的片段具有更大的優勢，其中衣殼蛋白編碼序列為1 982 bp，甲基轉移酶僅為545 bp。

綜上所述，通過本研究發現，對HEV進行基因分型，可以不對病毒全部基因組序列進行測序，只需設計合適的引物擴增出衣殼蛋白或甲基轉移酶，并將PCR產物測序作進化樹分析即可，從而為HEV的分型找到了一種更簡便、更快速的方法。當然這只是從生物信息學的角度探討HEV的初步分型，至于臨床的具體應用還有待于進一步的探討和研究。

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Capsid protein and methyltransferase can be used for genotyping of hepatitis E virus

HULing-ling,WANGYue-rong△

(DepartmentofLaboratoryMedicine,ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoShanghaiTCMUniversity,Shanghai200071,China)

Objective To understand the part of the coding region can be used as the basis for the genotyping of hepatitis E virus(HEV).Methods Thirty-five full-length sequences of HEV currently available in GenBank were download,and sequence alignment and evolutionary analysis of these thirty-five full-length sequences and part of the coding region were done.Results The complete genome of HEV was 7.5 kb in length，while Capsid Protein was 1 982 bp,Methyltransferase was 545 bp.The result of sequence alignment and evolutionary analysis of the two kinds of protein were consistent with the complete genome of HEV.Conclusion The sequence of Capsid Protein and Methyltransferase is shorter,and can be used as the basis for the genotyping of HEV,which is more simple and rapid.

hepatitis E virus; genotype; capsid protein; methyltransferase

胡玲玲，女，碩士，檢驗師，主要從事生物化學與分子生物學的研究。

△通訊作者，E-mail：wangyuerong1213@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.020

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1672-9455(2015)11-1545-02

2014-12-25

2015-02-18)