科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C AUX鑒定酵母樣真菌的臨床價(jià)值

趙琳琳，王江元，艾 清(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130031)

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科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C AUX鑒定酵母樣真菌的臨床價(jià)值

趙琳琳，王江元，艾 清△(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部檢驗(yàn)科，長(zhǎng)春 130031)

目的 探討科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C AUX(簡(jiǎn)稱API20C)鑒定酵母樣真菌的對(duì)比研究。方法 收集該院微生物室2012～2013年無(wú)菌體液標(biāo)本分離出的酵母樣真菌121株，對(duì)所有菌株進(jìn)行科瑪嘉顯色培養(yǎng)鑒定和API20C鑒定。通過(guò)基因序列分析法將真菌準(zhǔn)確鑒定到種。結(jié)果 顯色培養(yǎng)基除13株無(wú)法鑒定、8株鑒定錯(cuò)誤外其余菌株均鑒定正確，正確率為92.59% (100/108)。API20C除5株鑒定錯(cuò)誤、4株無(wú)鑒定結(jié)果外其余菌株均鑒定正確，正確率為92.56%(112/121)；其中對(duì)顯色培養(yǎng)能鑒定菌株的正確率為95.37%(103/108)，對(duì)顯色培養(yǎng)無(wú)法鑒定菌株的正確率為69.23%(9/13)。結(jié)論 科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C方法對(duì)大多數(shù)臨床分離菌株能夠準(zhǔn)確鑒定到種，API20C對(duì)少見(jiàn)真菌和顯色不典型菌種的鑒定有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

酵母菌； API20C AUX； 顯色培養(yǎng)； 序列分析； DNA

近年來(lái)，由于廣譜抗菌藥物的不規(guī)范使用、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，真菌引起的感染逐年上升[1-2]。有報(bào)道顯示白色酵母樣真菌的藥物敏感性高于非白色酵母樣真菌，不同菌種的酵母樣真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性和耐藥性不同，所以真菌的準(zhǔn)確鑒定對(duì)指導(dǎo)臨床用藥尤為重要[3-5]。臨床工作中常用的真菌鑒定方法有科瑪嘉顯色培養(yǎng)法、API20C AUX(簡(jiǎn)稱API20C)等生化反應(yīng)鑒定卡，本研究以分子生物學(xué)方法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C鑒定酵母樣真菌的能力進(jìn)行評(píng)估[6-7]。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集該院微生物室2012年1月至2013年12月無(wú)菌體液和血液標(biāo)本中分離出的酵母樣真菌共121株(已剔除同一患者同一部位或不同部位標(biāo)本反復(fù)檢出的相同菌株)，干濾紙片法-80 ℃保存。

1.2 質(zhì)控菌株 選取3株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株：白色假絲酵母菌(ATCC90028)、光滑球擬假絲酵母菌(ATCC90030)、熱帶假絲酵母菌(ATCC1463)，標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 儀器與試劑 LD5-10B低溫離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技)，T-100 PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司)，BC-J80S隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠)。PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工)，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(法國(guó)梅里埃)，API20C AUX鑒定卡(法國(guó)梅里埃)。

1.4 真菌顯色培養(yǎng)鑒定 所有菌株接種于沙氏培養(yǎng)基后36 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)1次上述操作，使真菌充分復(fù)蘇并分離出單個(gè)菌落。挑取沙氏培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)72 h后判定結(jié)果(每24 h觀察1次顯色情況)：綠色、翠綠色菌落為白色假絲酵母菌；藍(lán)灰色、鐵灰色菌落為熱帶假絲酵母菌；粉紅色模糊有微毛菌落為克柔假絲酵母菌；紫紅色光滑菌落為光滑球擬假絲酵母菌；顯色不典型和白色菌落為無(wú)法鑒定的其他假絲酵母菌。

1.5 真菌API20C鑒定 配制所有菌株的菌懸液(2.0 Mac)，取100 μL菌懸液至API C Medium培養(yǎng)基，混均后加入API20C真菌鑒定試劑條，29 ℃培養(yǎng)48～72 h后與陰性孔對(duì)照，閱讀生化譜。生化譜輸入API20C 3.0系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀：鑒定百分率≥80%且T≥0為“可接受的鑒定”，鑒定百分率<80%為“無(wú)鑒定結(jié)果”。

1.6 分子生物學(xué)鑒定 采用直接煮沸法提取真菌DNA，選取真菌通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6-7]。PCR體系為50 μL：PCR Master 25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，無(wú)菌雙蒸水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析，從而將所有菌株準(zhǔn)確鑒定到種。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)量控制 3株標(biāo)準(zhǔn)菌株白色假絲酵母菌(ATCC 90028)、光滑球擬假絲酵母菌(ATCC 90030)、熱帶假絲酵母菌(ATCC 1463)通過(guò)科瑪嘉顯色培養(yǎng)、API20C、基因序列分析法均能準(zhǔn)確鑒定至種。見(jiàn)圖1。

2.2 顯色培養(yǎng)鑒定結(jié)果 顯色培養(yǎng)基僅能鑒定4種常見(jiàn)的酵母樣真菌，有13株無(wú)法鑒定，鑒定率為89.26%(108/121)，與國(guó)內(nèi)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。其中108株菌株的鑒定結(jié)果中有8株與基因序列分析結(jié)果不符，正確率為92.59%(100/108)。

2.3 API20C鑒定結(jié)果 13株顯色無(wú)法鑒定菌株經(jīng)API20C鑒定，除1株近平滑假絲酵母菌和2株葡萄牙假絲酵母菌鑒定錯(cuò)誤、1株白色假絲酵母菌無(wú)鑒定結(jié)果外，其余菌株均鑒定正確，正確率為69.23%(9/13)。108株顯色鑒定至種菌株經(jīng)API20C鑒定，除1株白色假絲酵母菌和1株熱帶假絲酵母菌鑒定錯(cuò)誤、1株季也蒙假絲酵母菌和2株熱帶假絲酵母菌無(wú)鑒定結(jié)果外，其余菌株均鑒定正確，正確率為95.37%(103/108)。API20C的總正確率為92.56%(112/121)，接近國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]。見(jiàn)表1。

注：1表示白色假絲酵母菌(ATCC 90028)；2表示熱帶假絲酵母菌(ATCC 1463)；3表示光滑球擬假絲酵母菌(ATCC 90030)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株顯色結(jié)果

注：括號(hào)內(nèi)為菌株數(shù)。

3 討 論

本研究以分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)科瑪嘉顯色培養(yǎng)和API20C的鑒定能力進(jìn)行評(píng)估。從菌種庫(kù)中選取的少見(jiàn)菌種的菌株比例常較臨床分離菌株高，這與臨床實(shí)際情況不符。本研究菌株收集2012年1月至2013年12月臨床無(wú)菌體液和血液標(biāo)本中分離出的不同患者的全部酵母樣真菌，在菌種構(gòu)成上與臨床符合，因此得出的結(jié)果更能反映顯色培養(yǎng)和API20C在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

顯色培養(yǎng)基鑒定結(jié)果顯示，8株菌株顯色培養(yǎng)錯(cuò)誤鑒定，顯色培養(yǎng)可鑒定菌種內(nèi)的2株常見(jiàn)菌株無(wú)法鑒定，可能原因：(1)個(gè)人顏色辨別能力不同。如藍(lán)灰色、藍(lán)紫色、紫紅色辨別的差異。(2)常見(jiàn)菌株在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上顯色不典型。如本組顯白色的白色假絲酵母菌和顯橘紅色的光滑球擬假絲酵母菌，這2株菌株在顯色培養(yǎng)基可鑒定至菌種，但顯色培養(yǎng)基均無(wú)法鑒定。(3)少見(jiàn)菌株顯出與常見(jiàn)菌株相似的顏色。如1株葡萄假絲酵母菌和1株季也蒙假絲酵母菌均顯示紫紅色，易錯(cuò)誤鑒定為光滑球擬假絲酵母菌；1株阿薩希絲孢酵母顯出綠色，易錯(cuò)誤鑒定為白色假絲酵母菌。API20C鑒定結(jié)果表明，有9株菌株鑒定錯(cuò)誤或無(wú)鑒定結(jié)果，其中包括6株常見(jiàn)菌株(2株白色假絲酵母菌、3株熱帶假絲酵母菌和1株近平滑假絲酵母菌)，原因可能為：(1)廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑的應(yīng)用使菌株的生化反應(yīng)不再典型。(2)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)不同，生化反應(yīng)結(jié)果不同?？片敿物@色培養(yǎng)基鑒定正確率為92.59%，API20C鑒定酵母樣真菌的總正確率為92.56%，說(shuō)明科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和API20C能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)臨床分離菌株準(zhǔn)確鑒定到種。但是臨床工作中對(duì)顯色培養(yǎng)可以鑒定的菌株不再進(jìn)行API20C的鑒定，所以應(yīng)該更加注重API20C對(duì)顯色無(wú)法鑒定菌株的鑒定能力的評(píng)估。本研究中顯色無(wú)法鑒定的13株菌株經(jīng)API20C鑒定，3株鑒定錯(cuò)誤，1株無(wú)鑒定結(jié)果，鑒定正確率僅為69.23%(9/13)，低于API20C的總鑒定正確率。但本研究中顯色無(wú)法鑒定菌株標(biāo)本量少，所以API20C對(duì)臨床分離的顯色無(wú)法鑒定的少見(jiàn)真菌和顯色不典型菌株的鑒定能力有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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2015-02-15)

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