乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值的變化及臨床意義*

王維維，陳 惠，王娟娟，費奇力，袁向亮，陳 謹，劉宏景，榮婷婷，李美星，沈立松(上海

交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092)

?

·論 著·

乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值的變化及臨床意義*

王維維，陳 惠，王娟娟，費奇力，袁向亮，陳 謹，劉宏景，榮婷婷，李美星，沈立松△(上海

交通大學醫學院附屬新華醫院檢驗科，上海 200092)

目的 分析乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群的絕對值的變化，以評估乙型肝炎患者機體的免疫水平。方法 選取2012年6月至2014年8月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院就診的109例乙型肝炎肝患者作為乙型肝炎組，另選取20例同期體檢健康者作為健康對照組。采集所有研究對象的促凝和肝素抗凝外周血，臨床檢測乙型肝炎病毒(HBV)抗原抗體免疫指標，采用實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測HBV-DNA載量，采用流式細胞術檢測其外周血各淋巴細胞亞群的百分比與絕對值。并根據乙型肝炎e抗原(HBeAg)表達水平及HBV-DNA載量將患者分為HBeAg陽性組與陰性組，以及HBV-DNA陽性組與陰性組，比較外周血各淋巴細胞亞群絕對值。結果 乙型肝炎患者外周血CD3+T細胞、CD4+T輔助細胞(CD4+Th細胞)、CD8+殺傷性T細胞(CD8+Tc細胞)、CD19+B細胞絕對數均低于健康對照組(P<0.05)，組間CD3-CD16+CD56+自然殺傷性細胞(NK細胞)絕對數比較差異無統計學意義(P>0.05)。HBeAg陰性患者外周血CD3+T、CD4+Th、CD8+Tc及CD19+B細胞絕對值均低于HBeAg陽性患者(P<0.05)，但CD3-CD16+CD56+NK細胞絕對值比較差異無統計學意義(P>0.05)；HBV-DNA陽性患者CD4+Th細胞絕對值低于HBV-DNA陰性患者(P<0.01)，其余各淋巴細胞亞群的絕對值比較差異均無統計學意義 (P>0.05)。結論 乙型肝炎患者外周血淋巴細胞絕對數量的變化可提示其免疫功能的紊亂。

乙型肝炎； 淋巴細胞亞群絕對數； 細胞免疫； 流式細胞術

我國是肝炎大國，據國家衛生計生委2013年統計數據報道，我國乙型肝炎每年的新發病例超過10萬，近年來乙型肝炎的發病率呈明顯上升趨勢。多項研究表明，在乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝臟損傷的過程中，多種免疫細胞參與其免疫應答過程，而機體的免疫狀態決定著HBV感染后疾病的轉歸及療效。本研究通過流式細胞術檢測乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群CD3+T細胞、CD4+T輔助細胞(CD4+Th細胞)、CD8+殺傷性T細胞(CD8+Tc細胞)、CD19+B細胞、CD3-CD16+CD56+自然殺傷細胞(NK細胞)的百分比和絕對數值，以評估乙型肝炎肝患者的免疫功能，為臨床免疫調節治療提供幫助和指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月至2012年8月在本院就診的109例乙型肝炎肝患者納入乙型肝炎組，其中男64例、女45例，年齡21～83歲，平均 53歲，排除合并自身免疫性疾病、其他類型肝炎等疾病者。另選取同期在本院體檢健康的志愿者20例納入健康對照組，其中男11例、女性9例，年齡27～81歲，平均59歲。采集所有研究對象促凝和肝素抗凝外周血，均在4 h內進行檢測分析。

1.2 儀器與試劑 美國雅培i2000化學發光免疫分析儀及其配套試劑；美國ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀及上海匹基生物有限公司生產試劑；美國強生全自動生化分析儀及其配套試劑。美國Beckman Coulter FC500流式細胞儀；藻紅蛋白花青苷7(PC7)標記CD45(CD45-PC7)、異硫氰酸熒光素標記CD4(CD4-FITC)/藻紅蛋白標記CD8(CD8-PE)/藻紅蛋白花青苷5標記CD3(CD3-PC5)、CD3-FITC/CD(16+56)-PE、德克薩斯紅標記CD19(CD19-ECD)，以及流式計數磁珠(Flow Counter)均購自美國Beckman Coulter公司。所用細胞裂解液為自行配制的氯化銨溶液。

1.3 方法

1.3.1 HBV抗原抗體免疫指標及肝功能指標檢測 采用化學發光免疫分析儀檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)吸光度/臨界值比值(S/CO值)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)S/CO值及乙型肝炎核心抗體(HBcAb)S/CO值；采用實時熒光定量PCR儀檢測乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)；采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及線粒體天門冬氨酸氨基轉移酶同工酶(m-AST)。

1.3.2 外周血各淋巴細胞絕對值的測定 采用流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞各亞群百分比及絕對值，具體方法如下。(1)流式細胞儀的校準：采用Beckman Coulter的Flow Check和Flow Set調節儀器的光電倍增管(PMT)電壓、熒光補償及靈敏度，使用CXP分析軟件進行結果分析。(2)標本處理：取2支流式細胞儀專用試管，分別做好相應標記，1號管加入抗體CD45-PC7、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5 各10 μL，2號管加入抗體CD45-PC7、CD3-FITC/CD(16+56)-PE、CD19-ECD各10 μL，加入采集的肝素抗凝外周血50 μL，渦旋震蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入氯化銨裂解液，室溫避光孵育10 min，上機前加入50 μL的流式計數磁珠，渦旋混勻，上機檢測，分析各淋巴細胞亞群的百分比及絕對值。

1.3.3 觀察指標 分析兩組HBV免疫指標及肝功能指標的分布情況，比較兩組外周血各淋巴細胞亞群百分比、絕對值及CD4/CD8比值。根據乙型肝炎患者HBeAg的表達，將所有患者分為HBeAg陽性組(HBeAg≥250 IU/mL)與HBeAg陰性組(HBeAg<250 IU/mL)，比較外周血各淋巴細胞亞群絕對值；同樣根據HBV-DNA的表達將所有患者分為HBV-DNA陽性組(HBV-DNA≥1.0×103IU/mL)與HBV-DNA陰性組(HBV-DNA<1.0×103IU/mL)，比較外周血各淋巴細胞亞群絕對值。

2 結 果

2.1 兩組HBV抗原抗體免疫指標及肝功能指標檢測情況 109例乙型肝炎組患者中HBsAg≥250 IU/mL者72例、<250 IU/mL者37例、無一例小于0.05 IU/mL者，HBsAb≥10 mIU/mL者6例、<10 mIU/mL者103例，HBeAg的S/CO值大于或等于1.0者27例、小于1.0者82例，HBeAb 的S/CO值小于或等于1.0者65例、大于1.0者44例，HBcAb的S/CO值大于或等于1.0者105例、小于1.0者4例，HBV-DNA≥1.0×103IU/mL者49例、<1.0×103IU/mL者60例，ALT≥75 U/L者9例、<75 U/L者100例，AST≥38 U/L者24例、<38 U/L者85例，m-AST≥15 U/L者8例、<15 U/L者101例；健康對照組20例均HBsAg<0.05 IU/mL、HBV-DNA<1.0×103IU/mL、ALT<75 U/L、AST<38 U/L、m-AST<15 U/L，HBeAg與HBcAb的S/CO值均小于1.0、HBeAb的S/CO值均大于1.0，16例HBsAb≥10 mIU/mL、4例HBsAb<10 mIU/mL。

2.2 兩組外周血各淋巴細胞亞群百分比及CD4/CD8比值比較 兩組各細胞亞群百分比及CD4/CD8比值比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組外周血各淋巴細胞亞群百分比及CD4/CD8比值比較

表2 兩組外周血各淋巴細胞亞群絕對值比較

注：與健康對照組比較，aP<0.05。

2.3 兩組外周血各淋巴細胞亞群絕對值比較 乙型肝炎患者外周血CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞及CD19+B細胞的絕對值均低于健康對照組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組CD3-CD16+CD56+NK細胞絕對值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 HBeAg表達陽性患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值的變化 乙型肝炎HBeAg陽性組患者外周血CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞及CD19+B細胞的絕對值均高于HBeAg陰性組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；但兩組CD3-CD16+CD56+NK細胞絕對值比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：+表示陽性，-表示陰性；與HBeAg+組比較，aP<0.05；ns為差異無統計學意義。

圖1 HBeAg表達陽性與陰性患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值比較

2.5 HBV-DNA表達陽性患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值的變化 乙型肝炎HBV-DNA陽性組患者外周血CD4+Th細胞的絕對值降低，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)；但兩組CD3+T細胞、CD8+Tc細胞、CD19+B淋巴細胞及CD3-CD16+CD56+NK細胞絕對值比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：+表示陽性，-表示陰性；與HBV-DNA+組比較，aP<0.01；ns為差異無統計學意義。

圖2 HBV-DNA載量陽性與陰性患者外周血各淋巴細胞亞群絕對值比較

3 討 論

我國是乙型肝炎高發流行區，多年來乙型肝炎報告病例居所有法定傳染病的首位，約占傳染病患者總數的1/3，其發病機制目前尚不明確，但多項研究認為機體的免疫狀態和疾病的進程密切相關。機體正常免疫功能的發揮需要T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞等眾多免疫細胞的參與。淋巴細胞亞群的百分比和絕對數是反映機體免疫功能的重要標志，T淋巴細胞參與細胞免疫，其中包括CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞；B細胞參與機體體液免疫；NK細胞參與天然免疫，在抗感染、抗腫瘤、移植免疫、自身免疫疾病等方面發揮重要作用[1-2]。機體感染HBV后外周血各淋巴細胞亞群間的平衡被打破，主要表現為各細胞亞群絕對細胞數和功能的改變，這種變化可反映機體的細胞免疫狀態。

乙型肝炎患者免疫細胞的數量與疾病的發生、發展有著密切的關系。目前關于肝炎患者淋巴細胞亞群的研究多集中在T淋巴細胞亞群百分比的研究[2-5]。也有研究者采用雙平臺法探討T淋巴細胞亞群的數量變化[4]，即以流式細胞儀測得T淋巴細胞亞群的百分比，以血細胞分析儀測得白細胞數目，通過計數換算出T淋巴細胞亞群的絕對值，該方法存在不可避免的系統誤差，使淋巴細胞亞群絕對數的準確性大打折扣[6]。本研究使用流式細胞儀和流式計數磁珠單平臺法直接計數乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞的絕對數，具有更好的準確性[6]，可以更全面地評估乙型肝炎患者機體的免疫水平。

研究發現，乙型肝炎組和健康對照組外周血中CD3+T淋巴細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞、CD19+B淋巴細胞、NK細胞百分比比較差異均無統計學意義(P>0.05)；但乙型肝炎患者外周血中CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞、CD19+B淋巴細胞的絕對值均低于健康對照組(P<0.05)，提示乙型肝炎患者機體免疫功能低下，致使HBV感染后機體存在不同程度的免疫損傷和炎性反應，導致乙型肝炎朝著慢性肝炎、肝硬化和肝癌的方向進展。這與早期使用雙平臺計數T淋巴細胞亞群的研究結果相符，且此前的研究還發現因重癥肝病死亡者的淋巴細胞亞群絕對值與存活者比較有下降趨勢[4]。

此外，有研究揭示HBeAg陽性患者外周血CD8+T淋巴細胞百分比低于HBeAg陰性者[7]，但本研究結果發現，與HBeAg陽性患者比較，HBeAg陰性患者外周血CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞、CD19+B淋巴細胞絕對值均下降(P<0.05)。T淋巴細胞亞群在HBeAg陰性患者的發病及轉歸中發揮著重要作用[8]，HBeAg陰性患者淋巴細胞亞群的減少與免疫功能紊亂，更加不利于宿主對病毒的清除[9]。為了研究乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群的絕對值與HBeAg水平的關系，本研究按照HBeAg表達水平將乙型肝炎患者分為HBeAg陽性組與陰性組，結果顯示乙型肝炎HBeAg陽性組患者外周血CD3+T細胞、CD4+Th細胞、CD8+Tc細胞及CD19+B細胞的絕對值均高于HBeAg陰性組(P>0.05)。

另有研究發現，HBV-DNA 陽性患者外周血CD4+T 細胞、CD8+T細胞百分比減少[10]，但也有文獻報道乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群與HBV-DNA病毒載量無明顯的相關性[11]。為了研究乙型肝炎患者外周血各淋巴細胞亞群的百分比及絕對值是否和HBV-DNA載量有關，本研究將乙型肝炎患者按照HBV-DNA載量分為HBV DN陽性組和陰性組，研究發現乙型肝炎HBV-DNA陽性組外周血CD4+Th細胞絕對值降低(P<0.05)，而CD3+T細胞、CD8+Tc細胞的絕對值雖有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。研究結果的差異可能和HBV-DNA 陽性組病毒載量的高低有關[12]。

綜上所述，本研究揭示了乙型肝炎患者機體免疫功能受損、紊亂，為臨床的免疫預防和治療提供了依據。改善乙型肝炎患者機體的免疫狀態，有助于恢復機體的免疫應答、控制炎性反應、抑制并發感染；也有助于抑制HBV的復制。臨床可以通過免疫調節和治療減少乙型肝炎進展為肝硬化和肝癌的概率。

[1]田志剛，魏海明，孫汭．NK細胞免疫識別及其調節機制與免疫相關性疾病[J]．中國科學技術大學學報，2008，38(8)：896-904．

[2]施長友，張永樂．慢性乙型肝炎患者T淋巴細胞亞群與自然殺傷細胞活性分析[J]．中華醫院感染學雜志，2012，22(20)：4545-4546．

[3]李秀梅，梁樹人，李順天，等．乙型肝炎患者外周血T細胞亞群的分析及意義[J]．山東醫藥，2012，52(20)：63-65．

[4]辛紹杰，鄒正升，李保森，等．慢性乙型重型肝炎患者外周血各亞群淋巴細胞絕對值的特點[J]．第二軍醫大學學報，2006，27(4)：413-416．

[5]謝知兵，李年豐．重型肝炎CD4及CD8淋巴細胞亞群的檢測和意義[J]．細胞與分子免疫學雜志，2010，26(6)：587-588．

[6]張福杰，姚均，趙紅心，等．絕對計數系統的臨床應用評估[J]．中華檢驗醫學雜志，2005，28(4)：442-444．

[7]吳濤，蔡篤運，林鋒，等．慢性乙型肝炎和重型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群與HBV-DNA、HBeAg的關系[J]．現代預防醫學，2012，39(17)：4517-4522．

[8]劉小琴．抗病毒治療對HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群狀態的影響[J]．檢驗醫學與臨床，2014，11(5)：595-600．

[9]朱銀芳，顧錫炳，蔣亦明，等．HBeAg陰性的慢性乙型病毒性肝炎外周血T細胞亞群的變化[J]．現代中西醫結合雜志，2011，20(21)：2625-2626．

[10]馮廣貴．慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T 細胞亞群變化分析[J]．檢驗醫學與臨床，2010，7(1)：21-22．

[11]張健珍，曾春燕，張春蘭，等．不同臨床類型HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群的變[J]．實用肝臟病雜志，2012，15(6)：508-510．

[12]朱蘇蘭，魯陳，熊德琴，等．慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細胞亞群分析及與病毒載量相關性研究[J]．檢驗醫學與臨床，2013，10(9)：1118-1120．

Changes of peripheral blood lymphocyte subsets absolute values in hepatitis B patients*

WANGWei-wei，CHENHui，WANGJuan-juan，FEIQi-li，YUANXiang-liang，CHENJin，LIUHong-jing，RONGTing-ting，LIMei-xing，SHENLi-song△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedXinhuaHospitalofSchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200092,China)

Objective To analyze the changes of absolute values of peripheral blood lymphocyte subsets in the patients with hepatitis B for evaluating their immune level.Methods 109 cases of hepatitis B in our hospital from Jun. 2012 to Aug. 2014 were selected as the hepatic B group and contemporaneous 20 individuals of healthy physical examination as the healthy control group.The procoagulation and heparin anticoagulation blood was collected in all research subjects and clinically detected the immune indexes of hepatitis B virus(HBV) antigens and antibodies.The real time PCR was adopted to detect HBV-DNA loads and the flow cytometry was adopted to detect the percentages and absolute values of lymphocyte subsets.Results The absolute numbers of CD3+T cells,CD4+Th cells,CD8+Tc cells and CD19+B cells were significantly lower than those in the health control group (P<0.05).The absolute numbers of CD3-CD16+CD56+NK cells had no statistically significant differences between the two groups(P>0.05).The absolute values of CD3+T cells,CD4+Th cells,CD4+Tc cells and CD19+B cells in the HBeAg negative patients were lower than those in the HBeAg positive patients (P<0.05),but the absolute value of CD3-CD16+CD56+NK cells had no statistical difference(P>0.05).The absolute value of CD4+Th cells in the HBV-DNA positive patients was lower than that in the HBV-DNA negative patients (P<0.01).The absolute values of other lymphocyte subsets had no statistical differences between the two groups(P>0.05).Conclusion The absolute number changes of peripheral blood lymphocytes in the hepatic B patients could prompt their immune function disorder.

hepatitis B； absolute numbers of lymphocyte subsets； cellular immunity； flow cytometry

國家自然基金青年項目(81301788)；上海市教委青年教師資助計劃(JDY11042)。

王維維，女，博士在讀，臨床檢驗主管技師，主要從事臨床流式細胞術檢驗、臨床免疫方面的研究。

△通訊作者，E-mail：lisongshen@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.002

A

1672-9455(2015)06-0723-04

2014-08-08

2014-12-17)