白色念珠菌實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測體系的建立*

游亞蘭，賀湘玲△，方亦兵，張 兵，鄧中平，鐘禮立，劉 華，朱秀娟，鄒潤英，田 鑫，鄒 惠

(1.湖南省人民醫(yī)院，長沙 410005；2.湖南省衛(wèi)生廳，長沙 410008；3.湖南圣湘生物有限公司，長沙 410205)

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·論 著·

白色念珠菌實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測體系的建立*

游亞蘭1，賀湘玲1△，方亦兵2，張 兵1，鄧中平3，鐘禮立1，劉 華1，朱秀娟1，鄒潤英1，田 鑫1，鄒 惠1

(1.湖南省人民醫(yī)院，長沙 410005；2.湖南省衛(wèi)生廳，長沙 410008；3.湖南圣湘生物有限公司，長沙 410205)

目的 建立白色念珠菌實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測體系，實現(xiàn)白色念珠菌的早期、快速檢測，為臨床醫(yī)生對白色念珠菌感染的診斷提供指導(dǎo)。方法 使用白色念珠菌及其他真菌標(biāo)準(zhǔn)株，利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7設(shè)計引物探針。同時對鎂離子(Mg2+)、三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)、引物及探針濃度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選出最佳反應(yīng)體系，并驗證反應(yīng)體系的特異性、重復(fù)性，分析反應(yīng)體系的最低檢測限，對臨床分離出的45例白色念珠菌進(jìn)行檢測。結(jié)果 設(shè)計的引物探針僅能對白色念珠菌進(jìn)行特異性擴增，反應(yīng)體系不同底物濃度與Ct值之間成良好的線性關(guān)系，反應(yīng)體系的最低檢測限為5 CFU/mL，且反應(yīng)體系穩(wěn)定性、重復(fù)性好，對臨床分離菌株的檢測陽性率為100%。結(jié)論 成功設(shè)計了白色念珠菌特異性的引物探針，并建立了實時熒光定量PCR檢測體系，能快速、準(zhǔn)確地檢出白色念珠菌。

白色念珠菌； 感染； 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

侵襲性真菌感染(IFI)已經(jīng)成為繼細(xì)菌感染之后造成國內(nèi)外院內(nèi)感染的重要原因[1-2]。念珠菌為IFI最常見的真菌，其中以白色念珠菌最為常見[3-4]。目前，用于IFI診斷的方法主要包括培養(yǎng)、組織病理學(xué)方法、影像學(xué)方法、血清學(xué)方法等。由于IFI的臨床表現(xiàn)常無特異性，給疾病的早期診斷帶來了困難。隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于真菌的檢測[5-6]。本試驗通過設(shè)計白色念珠菌特異引物和熒光探針，提取白色念珠菌DNA并進(jìn)行擴增，建立白色念珠菌實時熒光定量PCR檢測技術(shù)平臺，為臨床白色念珠菌的實時熒光定量PCR檢測奠定實驗室基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及標(biāo)本來源 白色念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、季也蒙假絲酵母菌、清酒假絲酵母、奧黙畢赤假絲酵母、棒曲霉、雜色曲霉、產(chǎn)黃青霉、少根根霉、毛霉菌、尖孢鐮孢霉、串珠鐮刀菌、馬爾尼菲青霉均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；新型隱球菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌均由湖南省人民醫(yī)院微生物室提供。乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)、肺炎支原體(MP)、衣原體、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)、結(jié)核分枝桿菌(TB)、EB病毒(EBV)、柯薩奇病毒A16型(Cox A16)、腸道病毒71型(EV 71)核酸均由湖南圣湘生物有限公司提供。健康人全血采自湖南省人民醫(yī)院健康志愿者。選取2011年12月至2013年2月湖南省人民醫(yī)院微生物室從不同臨床無菌標(biāo)本培養(yǎng)中分離出的白色念珠菌45例作為臨床檢測標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司。緩沖液、0.1 mol/L三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTP)、1 mol/L氯化鎂(MgCl2)、生理鹽水、Hex內(nèi)標(biāo)反應(yīng)底物及引物探針、一步裂解法DNA提取試劑盒、濃縮裂解法DNA提取試劑盒均由湖南圣湘生物有限公司提供。血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。美國Applied Biosystems 公司7500熒光定量PCR儀，美國Stratagene Mx3000P實時熒光定量PCR儀。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)高壓蒸汽滅菌(121 ℃，30 min)后無菌操作倒入平板。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)及制備 霉菌接種于PDA平板，37 ℃培養(yǎng)72 h；念珠菌及新型隱球菌接種于PDA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。均制成濃度約107CFU/mL的混懸液，-80 ℃保存。

1.3.2 核酸提取 (1)標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的提取方法：采用濃縮裂解結(jié)合加熱法，取200 μL標(biāo)本，加入等體積的濃縮液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入100 μL核酸釋放劑，充分震蕩混勻，95 ℃加熱10 min，間隔3～5 min震蕩10 s，靜置冷卻，作為待測標(biāo)本。(2)人類基因組、細(xì)菌、病毒及其他病原菌核酸提取：人類基因組提取按照天根生化科技有限公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒方法提取；細(xì)菌及HBV、MP、HCMV、TB、EBV采用一步裂解法核酸提取試劑盒提取DNA；HCV、HIV、Cox A16、EV 71采用由湖南圣湘生物科技有限公司提供的RNA磁珠法提取試劑盒提取。

1.3.3 引物探針設(shè)計及產(chǎn)物測序 在基因庫(NCBI)中下載多種真菌的基因組序列，找出白色念珠菌相對保守的基因區(qū)域，利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7軟件設(shè)計引物探針，引物探針由美國Invitrogen公司合成。特異性擴增產(chǎn)物送至上海生工測序。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系內(nèi)各成分不同含量擴增效果比較，MgCl2溶液分別選取每人份0.1、0.3、0.5、0.7 μL 4個梯度，dNTP分別選取每人份0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL 5個梯度，引物分別選取每人份5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 pmol，探針分別選取每人份5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 pmol，在反應(yīng)程序相同的條件下選取最佳反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。

1.3.5 特異性與重復(fù)性試驗 分別對所提取真菌、細(xì)菌、病毒及人類基因組等的核酸進(jìn)行PCR擴增，以檢驗反應(yīng)體系對白色念珠菌的特異性，PCR反應(yīng)條件同前。批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗選用107～102CFU/mL 6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(記為1～6號)所提取的DNA為模板，批內(nèi)重復(fù)性試驗對同一模板、同一反應(yīng)體系同時進(jìn)行5次重復(fù)測定，批間重復(fù)性試驗對同一樣本在反應(yīng)體系相同的條件下進(jìn)行連續(xù)5 d重復(fù)測定，計算各自循環(huán)閾值(Ct)的變異系數(shù)(CV)。

1.3.6 線性范圍測定和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 標(biāo)準(zhǔn)株用生理鹽水稀釋成107～101CFU/mL，分別按照濃縮裂解結(jié)合加熱的方法提取DNA進(jìn)行擴增，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 最低檢測限分析試驗 選取線性范圍內(nèi)能全部測出的最低濃度，用生理鹽水將該濃度的標(biāo)準(zhǔn)株混懸液進(jìn)行1∶1、1∶2、1∶3、1∶4稀釋后提取DNA后擴增，重復(fù)8次，找出反應(yīng)全部呈陽性的最低濃度即為反應(yīng)最低檢測限。

1.3.8 Hex內(nèi)標(biāo)分析 將標(biāo)準(zhǔn)株稀釋成106～103CFU/mL 4個梯度，提取DNA進(jìn)行擴增，每一反應(yīng)中分別加入等量的Hex內(nèi)標(biāo)反應(yīng)體系，監(jiān)測PCR假陰性結(jié)果的發(fā)生。

1.3.9 臨床檢測 針對臨床分離培養(yǎng)的白色鏈珠菌標(biāo)本，采用濃縮裂解結(jié)合加熱的方法提取DNA進(jìn)行擴增，PCR反應(yīng)條件同前。

2 結(jié) 果

2.1 引物探針設(shè)計與PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 通過多種真菌基因序列進(jìn)行比對，最后確定白色念珠菌RSR1基因特異性較好，設(shè)計的引物探針如下，上游引物(F)：5′-CAGTGCTGGTGGTAGTAGTGGATT-3′；探針(P)：FAM-ACGTG TTACATTGATGCTTCTTAATCGAT-3′；反向引物(R)：5′-TGCTGTTTTGGT GGGAGTGAT-3′。試驗特異性擴增產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析，序列均在設(shè)計引物探針?biāo)谀康幕騾^(qū)域。

2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 通過對不同濃度的Mg2+、dNTPs、引物、探針進(jìn)行實驗，結(jié)果顯示在MgCl20.1 μL、dNTPs 0.3 μL、F/R 5 pmol、P 7.5 pmol、Taq酶2.0 μL、模板DNA 10 μL，總反應(yīng)體系50 μL條件下反應(yīng)體系擴增效率最高、擴增曲線呈典型的“S”形。

2.3 特異性與重復(fù)性試驗結(jié)果 在同一反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系僅能對白色念珠菌進(jìn)行擴增，與其他核酸無交叉反應(yīng)，見圖1。表明實驗中所建立的反應(yīng)體系具有很好的特異性。批內(nèi)重復(fù)性試驗顯示，同一次實驗不同反應(yīng)之間同一濃度擴增曲線基本重合，見圖2；批間重復(fù)性試驗顯示，所獲得的相同濃度Ct值的平均值CV均小于5%，說明PCR檢測體系的重復(fù)性好。見表1。

圖1 特異性試驗結(jié)果

圖2 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4 線性范圍測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別提取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)株DNA后進(jìn)行擴增，在107～101CFU/mL濃度能擴增出典型的“S”型曲線，其線性范圍為107～101CFU/mL。線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。

2.5 最低檢測限分析 將10 CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)株混懸液稀釋后提取DNA進(jìn)行PCR擴增，重復(fù)8次。經(jīng)1∶1稀釋后能完全擴增，而其他濃度標(biāo)本未見擴增或僅部分?jǐn)U增，反應(yīng)體系能檢測的最低濃度可以達(dá)到5 CFU/mL。

表1 批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗Ct值比較

注：A為線性范圍；B為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 加入內(nèi)標(biāo)擴增結(jié)果 反應(yīng)體系中加入Hex熒光標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)體系后，PCR反應(yīng)結(jié)果與不加入內(nèi)標(biāo)的擴增效果相同，內(nèi)標(biāo)在建立的PCR反應(yīng)中進(jìn)行擴增與單獨進(jìn)行擴增均有明顯的擴增效果，而且Ct值基本一致、擴增曲線基本重合。對Ct值進(jìn)行方差分析，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明內(nèi)標(biāo)加入對本實驗的反應(yīng)體系無影響。

2.7 臨床真菌檢測結(jié)果 采用本實驗建立的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測臨床分離出的45例白色念珠菌，結(jié)果均為陽性，檢測率達(dá)100%，見圖4。

注：不同曲線代表不同標(biāo)本的擴增曲線。

圖4 臨床菌株P(guān)CR檢測結(jié)果

3 討 論

白色念珠菌是IFI最常見的病原菌，目前主要依靠傳統(tǒng)的檢測方法協(xié)助臨床診斷，但是傳統(tǒng)方法存在耗時長、陽性率低等缺陷，加之真菌感染缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，早期、快速診斷IFI仍然是困擾臨床工作者的問題之一[7-8]。

實時熒光定量PCR是新近發(fā)展的檢測方法，已廣泛應(yīng)用于多種病毒的臨床檢測[9-10]，而真菌感染的PCR檢測目前仍停留在實驗室階段。DNA的提取及引物探針的設(shè)計等因素是影響PCR檢測廣泛應(yīng)用于白色念珠菌的主要原因[10-11]。真菌DNA的提取方法包括磁珠法、膜吸附法、液氮碾磨法、機械破壁法等[12-13]。本研究選取濃縮裂解法，并在裂解過程中予以加熱處理以提高DNA的提取效率，取得了較理想的效果。國內(nèi)外已經(jīng)報道了各種可以用于念珠菌特異性檢測的基因區(qū)域，如ITS區(qū)域、FKS1及線粒體基因[14-15]。經(jīng)過比對，本研究發(fā)現(xiàn)RSR1基因區(qū)域適宜于設(shè)計引物探針，且通過特異性、重復(fù)性等試驗驗證，該引物探針能特異地檢測白色念珠菌，其最低檢測限可達(dá)到5 CFU/mL，并且對臨床分離株的檢測率達(dá)到100%，說明所建立的檢測體系不僅可以檢測標(biāo)準(zhǔn)株，同樣適用于臨床標(biāo)本的檢測。此外，實驗中Hex內(nèi)標(biāo)的加入能有效地避免假陰性結(jié)果，提高檢測體系的可靠性，給臨床檢測提供了更好的保障。

綜上所述，實時熒光定量PCR用以檢測白色念珠菌具有快速、特異的優(yōu)勢，通過本試驗獲取了白色念珠菌的DNA提取方法，并設(shè)計了特異性的引物探針，所建立的PCR檢測體系能夠準(zhǔn)確定量標(biāo)本中的病原體含量，為臨床標(biāo)本中白色念珠菌的PCR檢測奠定了實驗基礎(chǔ)，可更好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生對疾病進(jìn)行診斷與治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，應(yīng)用于臨床還需要動物及臨床試驗的進(jìn)一步驗證。

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Establishment of real-time fluorescent quantitative PCR assay system for Candida albicans*

YOUYa-lan1,HEXiang-ling1△,FANGYi-bing2,ZHANGBing1,DENGZhong-ping3,ZHONGLi-li1,LIUHua1,ZHUXiu-juan1,ZOURun-ying1,TIANXin1,ZOUHui1

(1.HunanProvincialPeople'sHospital,Changsha,Hunan410005,China;2.HealthDepartmentofHunanProvince,Changsha,Hunan410008,China;3.HunanSansureBiotechnologyCo.,Ltd.,Changsha,Hunan410205,China)

Objective To establish the real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR) assay system for realizing the rapid and accurate detection of Candida albicans to provide the guidance for the clinical doctors making the diagnosis of Candida albicans infection.Methods The standard Candida albicans strains and the other fungal standard strains were used in the experiment.The specific primers and probes for Candida albicans were designed by the Primer Premier 5.0 and Beacon Designer 7.7.At the same time the parameters of Mg2+,dNTPs,primers and probe concentration were optimized for finding out the best reaction system of PCR.The specificity and repeatability were verified and the lowest limit of detection of the reaction system was analyszed.Finally 45 clinically isolated 45 strains of Candida albicans were tested.Results The designed primers and probes only conducted the specific amplification,the different substrate concentrations of the reaction system showed the good linearity with the Ct value,the lowest limit of detection of reaction system was 5 CFU/mL with good stability and good repeatability,its positive detection rate for the clinically isolated strains reached 100%.Conclusion The Candida albicans FQ-PCR assays system may be established based on successfully designing the specific primer and probe,which could identify Candida albicans rapidly and accurately.

candida albicans； infection； real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

湖南省科技廳科技計劃項目(2013FJ6028)；湖南省科技廳社會發(fā)展支撐計劃重點項目(S2012S20321622)。

游亞蘭，女，碩士，臨床醫(yī)師，主要從事兒科血液腫瘤研究。△

，E-mail：hexiangl@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.007

A

1672-9455(2015)06-0737-03

2014-08-15

2014-12-19)