尼洛替尼以PU.1非依賴性調(diào)節(jié)K562細(xì)胞活性*

李有強(qiáng)，曾建明，姚子濤，肖 倩，王麗娜，李 沫

(1．廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；3.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞 523808)

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·論 著·

尼洛替尼以PU.1非依賴性調(diào)節(jié)K562細(xì)胞活性*

李有強(qiáng)1，2，曾建明1△，姚子濤3，肖 倩1，王麗娜1，李 沫1

(1．廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；3.廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞 523808)

目的 研究尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)錄因子PU.1的影響。方法 以不同濃度的尼洛替尼分別處理K562細(xì)胞48 h后，采用CCK-8法觀察K562細(xì)胞增殖活性的變化；采用Western blot法檢測(cè)PU.1的表達(dá)情況。結(jié)果 CCK-8法顯示細(xì)胞存活率隨尼洛替尼濃度的升高而下降，尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞株的半數(shù)抑制量(IC50)為51.9 nmol/L；Western blot法顯示尼洛替尼處理后PU.1的蛋白表達(dá)水平未見明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 尼洛替尼可抑制K562細(xì)胞活性，但其作用方式非依賴于PU.1。

尼洛替尼； K562細(xì)胞； Bcr-Abl； PU.1

尼洛替尼是人工合成的新型酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合斷裂點(diǎn)簇集區(qū)-艾貝爾遜白血病病毒(Bcr-Abl)融合蛋白三磷腺苷(ATP)結(jié)合位點(diǎn)，抑制Bcr-Abl蛋白的酪氨酸激酶活性，阻斷下游多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，達(dá)到有效治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的目的[1]。但由于信號(hào)傳導(dǎo)通路的復(fù)雜性，尼洛替尼通過(guò)Bcr-Abl調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路的機(jī)制尚未完全明確。PU.1蛋白是調(diào)控粒系分化的轉(zhuǎn)錄因子，不僅在造血干細(xì)胞向髓系分化的早期過(guò)程中起作用，還與細(xì)胞增殖活性有關(guān)。有研究表明，Bcr-Abl在mRNA翻譯水平通過(guò)多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白E2(hnRNP E2)抑制轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達(dá)[2]，而PU.1與C/EBPα有協(xié)同作用，可共同調(diào)節(jié)粒細(xì)胞分化增殖[3]。因此，本研究擬探討尼洛替尼作用于K562細(xì)胞株后對(duì)PU.1的影響，進(jìn)一步探索尼洛替尼治療CML的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株來(lái)源 K562細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院血液病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與試劑 尼洛替尼由諾華制藥公司提供。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞裂解液RIPA和電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影試劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；丙烯酰胺和雙丙烯酰胺均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)和磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自上海生工；蛋白Marker購(gòu)自北京賽百盛公司。PU.1單克隆抗體和β-actin單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 方法

1.3.1 K562細(xì)胞株的培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的K562細(xì)胞株在含有終濃度為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天換液傳代，細(xì)胞接種密度為每毫升1×105個(gè)。

1.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的0.5×104K562細(xì)胞接種于96孔板(每孔總體積為200 μL)，加入不同終濃度的尼洛替尼(0～100 nmol/L)作用48 h，相同體積的二甲基亞砜(DMSO)為陰性對(duì)照組，空白組為不含細(xì)胞和尼洛替尼，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2、飽和濕度下共計(jì)培養(yǎng)48 h后，取出96孔板，每孔加10 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀下測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A450值)。按公式計(jì)算存活率：存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%；根據(jù)公式計(jì)算半數(shù)抑制量(IC50)：IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)][4]。Xm為設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值，i為各濃度倍比濃度的對(duì)數(shù)值，ΣP為各組生長(zhǎng)抑制率之和，0.5為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

1.3.3 Western blot檢測(cè)PU.1的蛋白表達(dá) 用RIPA細(xì)胞裂解液裂解待測(cè)細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)蛋白含量。等量蛋白質(zhì)采用SDA-PAGE垂直電泳進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液[(含5%牛血清蛋白(BSA)的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)]4 ℃下封閉1 h后，加入PU.1單克隆抗體(1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下洗膜后加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)羊抗兔二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，ECL顯影。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 K562細(xì)胞增殖活性 比較各處理組細(xì)胞增殖抑制率，CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，隨尼洛替尼濃度的增加，K562細(xì)胞增殖明顯下降。尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞株的IC50為51.9 nmol/L。見表1。

表1 不同濃度尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞增殖活性的影響

注：χ2、P分別表示各處理組與陰性對(duì)照組比較的統(tǒng)計(jì)量；-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2 Western blot檢測(cè)PU.1蛋白表達(dá)結(jié)果 不同濃度的尼洛替尼 (40.0、45.0、51.9 nmol/L)作用于K562細(xì)胞48 h后PU.1的蛋白表達(dá)量與尼洛替尼處理后比較未見明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1。

注：1～3號(hào)泳道分別為40.0、45.0、51.9 nmol/L 尼洛替尼；4號(hào)泳道為DMSO對(duì)照組。

圖1 尼洛替尼對(duì)PU.1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

分子靶向藥物尼洛替尼能夠特異性地競(jìng)爭(zhēng)抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶活性，且具有較高的反應(yīng)率和良好的耐受性，已成為CML的一線治療方案。相對(duì)于第1代酪氨酸激酶抑制劑，第2代尼洛替尼具有選擇性更強(qiáng)、耐藥率更低的優(yōu)勢(shì)[1]。同時(shí)，由于酪氨酸激酶能催化多種底物蛋白質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)下游不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。因此，尋找Bcr-Abl的下游作用蛋白，對(duì)進(jìn)一步闡明尼洛替尼治療CML的分子機(jī)制具有重要意義。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用不同濃度的尼洛替尼處理K562細(xì)胞后，與K562細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PU.1的表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯差異，表明尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用非依賴于PU.1。

PU.1是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，其具有的“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合區(qū)能識(shí)別1個(gè)富含嘌呤GGAA/T(PU box)基因序列的核心DNA元件，并與之結(jié)合，故名PU.1[5]。PU.1不僅在造血干細(xì)胞向髓系分化的早期過(guò)程中起作用，還在后續(xù)的髓細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮作用。PU.1通過(guò)與造血相關(guān)基因啟動(dòng)子上的PU.1位點(diǎn)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如巨細(xì)胞集落刺激因子受體(M-CSFR)、粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)、CD11b、粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶、白細(xì)胞介素-7(IL-7)、IL-18和環(huán)氧化酶2(COX2)等。同時(shí)，CML轉(zhuǎn)歸與PU.1基因功能的恢復(fù)有關(guān)，PU.1基因功能恢復(fù)是CML治療好轉(zhuǎn)的一個(gè)重要指標(biāo)[6-8]。

目前，有研究表明PU.1與轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα存在協(xié)同作用，可共同調(diào)節(jié)粒細(xì)胞分化[3]，而且Bcr-Abl可通過(guò)hnRNP E2抑制C/EBPα的表達(dá)[2]。另外，在髓系細(xì)胞分化過(guò)程中，PU.1的發(fā)揮作用比C/EBPα更早，且在干擾素-α(IFN-α)或STI571治療好轉(zhuǎn)的CML患者身上發(fā)現(xiàn)PU.1表達(dá)上調(diào)[9]。另有研究表明，降低小鼠PU.1基因的表達(dá)能夠?qū)е滦∈蟀籽〉陌l(fā)生。因此本研究探討了在K562細(xì)胞株中，Bcr-Abl抑制劑尼洛替尼是否對(duì)PU.1的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CCK-8法探索尼洛替尼對(duì)K562細(xì)胞株增殖活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞存活率下降，說(shuō)明尼洛替尼作用于K562細(xì)胞后細(xì)胞增殖活性發(fā)生改變，可促進(jìn)細(xì)胞的死亡。另外，Western blot檢測(cè)顯示尼洛替尼不影響K562細(xì)胞中PU.1的表達(dá)，表明尼洛替尼未通過(guò)Bcr-Abl調(diào)節(jié)PU.1的表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子PU.1并不是Bcr-Abl的作用底物。

本實(shí)驗(yàn)闡明尼洛替尼可明顯影響K562細(xì)胞株的活性,但其作用方式并不依賴于轉(zhuǎn)錄因子PU.1，對(duì)進(jìn)一步探索Bcr-Abl下游相關(guān)分子具有一定的借鑒作用。

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Nilotinib for regulating K562 cell viability in PU.1-independent manner*

LIYou-qiang1，2,ZENGJian-ming1△,YAOZi-tao3,XIAOQian1,WANGLi-na1,LIMo1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510006,China;2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510405,China;3.InstituteofLaboratoryMedicine,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China)

Objective To investigate the effect of nilotinib on the viability and transcription factor PU.1 in K562 cells.Methods K562 cells were treated with different concentrations of nilotinib for 48 h;the CCK-8 method was adopted to observe the change of K562 cells proliferation viability;the expression of PU.1 was determined by using Western Blot．Results The CCK-8 method showed that the survival rate of K562 cells was decreased with the nilotinib concentration increase.The 50% inhibitory concentration(IC50) of niloinib to K562 cells was 51.9 nmol/L;the Western blot test indicated that the expression of PU.1 in K562 cells had no significant difference after niloinib treatment(P>0.05).Conclusion Nilotinib could inhibit the viability of K562 cells in a PU.1-independent manner.

Nilotinib； K562 cells； Bcr-Abl； PU.1

廣東省自然科學(xué)基金(S2012010008916)。

李有強(qiáng)，男，碩士，主管技師，主要從事臨床生化和臨床血液檢驗(yàn)?！?/p>

，E-mail：labo9@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.010

A

1672-9455(2015)06-0745-02

2014-10-11

2014-12-29)