胰島素對糖尿病大鼠下頜骨成骨細胞體外生物學活性的影響

陳 新，譚新偉，劉洪臣，馮 巖

(1.空軍總醫院口腔科,北京 100036；2.新疆維吾爾自治區巴州人民醫院口腔科 841000;3.解放軍進修學院口腔醫學研究院口腔科 ,北京 100036)

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·臨床研究·

胰島素對糖尿病大鼠下頜骨成骨細胞體外生物學活性的影響

陳 新1，譚新偉2，劉洪臣3，馮 巖1

(1.空軍總醫院口腔科,北京 100036；2.新疆維吾爾自治區巴州人民醫院口腔科 841000;3.解放軍進修學院口腔醫學研究院口腔科 ,北京 100036)

目的 探討糖尿病大鼠應用胰島素對下頜骨成骨細胞體外生物學活性的影響。方法 將20只7周齡的SD大鼠分為對照組(8只)與實驗組(12只)，實驗組大鼠注射四氧嘧啶建立糖尿病大鼠模型，建模后獲取下頜骨進行培養并提取成骨細胞，設置對照組并根據胰島素劑量設置各實驗組，采用噻唑藍(MTT)法檢測大鼠成骨細胞的增殖率，采用對硝基苯磷酸鹽(PNPP)法檢測骨細胞堿性磷酸酶(ALP)水平，并進行下頜骨成骨細胞糖攝取檢測，比較分析各組檢測結果。結果 加藥后48 h與72 h各不同劑量胰島素實驗組標本的吸光度值與對照組和實驗組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中以10-6mol/L劑量組的吸光度值最高。加藥后3、7、14 d各不同劑量胰島素實驗組標本的ALP水平與實驗組及對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；加藥后21 d 10-6mol/L及10-7mol/L胰島素實驗組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。2-NBDG加入20 min時吸光度值從高到低依次為10-6mol/L胰島素+對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組、實驗組、對照組；40 min時吸光度值從高到低依次為實驗組、10-6mol/L胰島素+對照組、對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組。結論 糖尿病大鼠應用胰島素后可改善其上頜骨成骨細胞的分化功能，同時對糖攝取量也具有明顯的抑制作用。

糖尿??； 胰島素； 下頜骨； 成骨細胞； 體外生物活性

糖尿病可對患者的骨整合形成產生明顯的影響，以往通常采用羥基磷灰石涂層進行改善，但常存在溶解及感染等不良事件，導致實施效果受到限制[1]。由于大部分糖尿病患者都需要長期注射胰島素[2]，臨床醫師在人工種植牙過程中逐漸豐富給藥思路，在通過頜骨局部給藥確保血糖控制的同時發揮其改善骨整合的作用[3]。而骨整合的良好改善與成骨細胞的作用密切相關[4-5]，目前關于糖尿病患者頜骨成骨細胞的臨床報道較為少見，本研究通過對糖尿病大鼠與健康大鼠開展相關研究，觀察其上頜骨成骨細胞分化與糖攝取量的相關表現，為下頜骨局部應用胰島素提供良好的依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取7周齡的SD大鼠20只，其中雌性、雄性大鼠各10只，體質量190～250 g，平均(223.7±5.3)g。將大鼠隨機分為對照組(8只)與實驗組(12只)。

1.2 糖尿病動物模型的建立 對照組大鼠經腹腔注射生理鹽水，劑量為100 mg/kg；實驗組大鼠經腹腔注射20 mg/mL的四氧嘧啶，劑量為200 mg/kg。待腹腔注射3 d后，檢測實驗組大鼠血糖，若空腹血糖為7.8 mmol/L或以上則糖尿病大鼠建模成功。所有實驗大鼠均根據《關于善待實驗動物的指導性意見》開展相關處理與操作。

1.3 方法

1.3.1 下頜骨成骨細胞培養 對照組大鼠無需測量血糖水平，將下頜骨成骨細胞培養于5.5 mmol糖培養基。實驗組大鼠在建模成功后10 d內均給予標準喂養，第11天將大鼠處死，應用酶消法聯合組織塊法對獲取的標本進行培養。將大鼠處死后置入乙醇中浸泡消毒5 min，依據無菌操作標準取出下頜骨，再次置于乙醇中浸泡消毒，然后于氯酸鈉內放置1 min。應用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)連續清洗標本3次，放至培養基中剔除標本組織的筋膜、肌肉、神經等，將全部牙齒拔除，再將處理標本清洗3次。將獲取標本剪成1 mm3小塊，注入其5倍體積的胰蛋白酶以有效地去除消化液。相同方式反復進行5次，離心處理后在所獲得的白色沉淀物中加入培養基與胎牛血清(FBS)，再置于培養瓶內。采用FBS抑制標本再消化，旋松培養瓶口后放置孵箱中培養。培養3 d后針對酶消法所獲得的細胞組織進行換液，7 d后針對組織塊進行換液，此后每3天進行1次換液。

1.3.2 下頜骨成骨細胞分化檢測 針對大鼠標本進行合理的分組，建立對照組(健康大鼠)、實驗組(糖尿病大鼠)、10-5mol/L胰島素實驗組、10-6mol/L胰島素實驗組及10-7mol/L胰島素實驗組。采用噻唑藍(MTT)法檢測大鼠成骨細胞的增殖率，采用對硝基苯磷酸鹽(PNPP)法檢測骨細胞堿性磷酸酶(ALP)，并將2項檢測結果進行統計學比較分析。

1.3.3 下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取檢測 針對大鼠標本進行合理分組，建立對照組(健康大鼠)、10-6mol/L胰島素+對照組、實驗組(糖尿病大鼠)、10-6mol/L胰島素+實驗組。熒光標記2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)的配置方法為0.01 mol/L PBS中加入2-NBDG粉末，濃度為200 μmol/L，將標本第5代細胞接種于玻片上，通過培養液反復處理后應用熒光顯微鏡進行觀察，再采用處理軟件獲取熒光積分吸光度值。

2 結 果

2.1 大鼠下頜骨成骨細胞增殖率比較 MTT法檢測結果顯示，在加藥后24、48、72 h不同劑量胰島素實驗組標本的吸光度與對照組和實驗組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；胰島素實驗組中，以10-6mol/L劑量組的吸光度最高。見表1。

表1 大鼠下頜骨成骨細胞吸光度比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與實驗組比較，bP<0.05。

2.2 大鼠下頜骨成骨細胞ALP水平比較 PNPP法檢測結果顯示，在加藥后3、7、14 d時不同劑量胰島素實驗組標本的ALP水平與實驗組和對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，21 d時10-6mol/L及10-7mol/L胰島素實驗組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，10-5mol/L胰島素實驗組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。在不同水平胰島素實驗組中ALP水平在3 d時以10-7mol/L胰島素實驗組最高，7、14 d時以10-6mol/L胰島素實驗組最高，21 d時以10-5mol/L胰島素實驗組最高。各組標本ALP水平在14 d內均隨時間延長而提高，14 d后均呈現下降。見表2。

表2 大鼠下頜骨成骨細胞ALP水平比較金氏單位)

注：與對照組比較，aP<0.05；與實驗組比較，bP<0.05。

2.3 大鼠下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取量比較 各組大鼠標本均呈現出熒光表現隨時間延長而增強的特征，將2-NBDG加入20、40 min時各組積分吸光度比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其吸光度值從高到低依次為10-6mol/L胰島素+對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組、實驗組、對照組；40 min時吸光度值從高到低依次為實驗組、10-6mol/L胰島素+對照組、對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組，見表3。

表3 大鼠下頜骨成骨細胞熒光積分吸光度比較

3 討 論

1型糖尿病在青少年中發病時會明顯抑制骨骼發育，在成人中發病還會影響骨密度，使骨質疏松的發生概率上升，造成各種骨折的發生并影響愈合速度[6]。而2型糖尿病的發生會升高患者的骨密度，但明顯降低骨強度[7]。上述差異主要是由于1型糖尿病患者處于胰島素絕對缺乏狀態，而2型糖尿病患者主要表現為胰島素抵抗[8]。通過不同的表現可以判斷，在骨骼的生長過程中胰島素可發揮合成代謝效用。本研究對大鼠成骨細胞的分化狀況進行檢測后發現，應用胰島素的實驗組大鼠其成骨細胞增殖率與ALP水平均提高，并且10-5～10-7mol/L胰島素劑量組具有不同程度的改善。在24～72 h中，10-6mol/L胰島素的促增殖效果最佳并且伴隨用藥時間的延長，細胞內ALP水平存在一定的劑量依賴性表現，提示長期應用胰島素后成骨細胞可能存在耐藥表現，敏感性下降。

相對于健康人群，糖尿病患者骨轉換率下降與骨量減少高發[9]，主要由患者血糖控制狀況所致，以往血糖控制較好者其不良事件的發生情況會受到明顯抑制[10]。本研究針對不同大鼠開展了成骨細胞糖攝取的相關實驗，結果顯示各組標本的熒光表現均隨時間延長而增強。在2-NBDG加入20 min時各組別熒光積分吸光度比較差異有統計學意義(P<0.05)，吸光度值從高到低依次為10-6mol/L胰島素+對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組、實驗組、對照組；2-NBDG加入40 min時各組別熒光積分吸光度比較差異有統計學意義(P<0.05)，吸光度值從高到低依次為實驗組、10-6mol/L胰島素+對照組、對照組、10-6mol/L胰島素+實驗組。表明在胰島素的作用下糖尿病大鼠成骨細胞糖攝取會受到限制，進而改善患者成骨細胞的狀態。

綜上所述，糖尿病大鼠應用胰島素后可改善上頜骨成骨細胞的分化功能，同時對糖攝取量也具有明顯的抑制作用。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.050

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1672-9455(2015)06-0836-02

2014-08-22

2014-12-29)