轉化生長因子-β1與冠狀動脈支架內再狹窄關系的探討*

黃 驥，王鳳鳴,黃 婕,唐素瓊,劉 筑,伊遠學,王旭開,裴 芳△(中國人民武裝警察部隊重慶市總隊醫院:.心血管內科;.科教中心，重慶 40006；.第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所心血管內科,重慶 40004)

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·論 著·

轉化生長因子-β1與冠狀動脈支架內再狹窄關系的探討*

黃 驥1，王鳳鳴1,黃 婕1,唐素瓊1,劉 筑2,伊遠學2,王旭開3,裴 芳1△(中國人民武裝警察部隊重慶市總隊醫院:1.心血管內科;2.科教中心，重慶 400061；3.第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所心血管內科,重慶 400042)

目的 探討轉化生長因子(TGF)-β1血漿水平及TGF-β1基因-509C/T單核苷酸多態性(SNP)與重慶地區漢族人群經皮冠狀動脈介入治療術后支架內再狹窄(ISR)發生的關系。方法 回顧性納入冠狀動脈支架術后行冠狀動脈造影隨訪的患者368例，根據復查造影的結果將其分為ISR組152例和無再狹窄(NISR)組216例。酶聯免疫吸附試驗檢測血漿TGF-β1水平，采用聚合酶鏈反應-限制片段長度多態性及基因測序的方法檢測TGF-β1基因-509C/T多態的基因型。結果 TGF-β1基因-509C/T多態的3種基因型和等位基因分布頻率ISR組和NISR組差異均有統計學意義(P<0.05)，TT基因型和T等位基因在ISR組所占比例顯著增加，與NISR組差異有統計學意義(P<0.05)；血漿TGF-β1水平ISR組高于NISR組，差異有統計學意義(P<0.05)，ISR組TGF-β1基因-509C/T多態TT和CT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平均顯著高于NISR組，差異有統計學意義(P<0.05)，各組內TT基因型血漿TGF-β1水平均高于CC和CT基因型，CT基因型又高于CC基因型，組內比較差異均有統計學意義(P<0.05)。Logistic回歸分析顯示，TT基因型、T等位基因(CT+TT基因型)和血漿TGF-β1是ISR發生的獨立危險因素(OR值分別為1.82、1.61和2.01，P<0.05)。結論 高血漿TGF-β1水平、TT基因型及T等位基因攜帶者顯著增加ISR的風險。

冠狀動脈疾病； 轉化生長因子-β1； 單核苷酸多態性； 支架； 冠狀動脈再狹窄

冠心病作為危害人類健康的“頭號殺手”受到廣泛關注。盡管現代介入治療技術的快速發展為解決冠狀動脈狹窄、心肌供血等問題提供了有效的治療手段，但術后半年內有10%～30%的患者會發生支架內再狹窄(ISR)，極大制約其臨床應用[1]。因此，ISR的防治已經成為當今全球醫學界研究的一項重要課題。近年研究發現，轉化生長因子-β1(TGF-β1)與ISR的發生和發展關系密切[2]。位于TGF-β1基因子區的-509C/T多態(rs1800469)被證明可以通過影響TGF-β1轉錄水平進而影響TGF-β1的表達產物水平，從而參與多種疾病的發生和發展，但迄今少有其與ISR關系的文獻報道[3]。本研究旨在探討TGF-β1基因-509C/T多態性與ISR的關系，并探討該多態性對血清TGF-β1水平的影響，為識別高危ISR患者，指導個體化治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性納入2009年6月至2014年6月成功接受冠狀動脈內支架置入術的重慶地區無血緣關系的漢族患者368例，其中男276例，女92例，所有患者均經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后超過0.5年，因常規檢查或再發心絞痛住院復查選擇性冠狀動脈造影(CAG)并檢測血漿TGF-β1水平；根據CAG結果，分為再狹窄組(ISR組)152例和無再狹窄組(NISR組)216例，兩組患者年齡、性別均匹配。患者術后CAG隨訪時間中位數為9個月。患有急性ST段抬高型心肌梗死及其他心臟病，如心肌病、風濕性心臟病、先天性心臟病、瓣膜病；嚴重心、肝、腎衰竭；近期有大創傷或者大手術、大出血；凝血功能障礙；風濕免疫性疾病；腫瘤；近期感染及慢性炎癥；對阿司匹林、肝素及氯吡格雷禁忌者均不作為研究對象。

1.2 CAG及PCI 按Judkins法行CAG，標準方法行冠狀動脈內支架置入術。患者術前常規服用阿司匹林(德國拜耳制藥有限公司)100～300 mg/d，頓服氯吡格雷(法國賽諾菲制藥有限公司)300 mg。冠狀動脈病變嚴重程度、長度和參照血管直徑的參數測定由專人(非術者)進行定量CAG分析。支架置入成功標準：殘余狹窄小于20%，血流分級為心肌梗死溶栓3級，無重要邊支閉塞、無夾層、無血栓，且住院期間不伴主要心臟不良事件。術后患者接受氯吡格雷片口服，1次/天，至少12個月；阿司匹林片100 mg口服，1次/天，終身服用；同時服用需要的其他藥物，如降壓、降脂及硝酸酯類藥物。ISR判定標準：隨訪時支架內或支架前后5 mm血管腔內徑狹窄程度大于或等于50%，參照血管為支架遠端正常血管[4]。

1.3 基因型檢測 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取受試者清晨空腹肘正中靜脈血2 mL，使用Tuangen公司全血基因組DNA提取試劑盒提取白細胞基因組DNA。采用聚合酶鏈反應-限制片段長度多態性(PCR-RFLP)檢測TGF-β1基因-509C/T多態基因型。根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)Primer-Blast工具在線設計特異性引物：正義鏈5′-CCCGGCTCCATTTCCAGGTG-3′，反義鏈5′-GGTCACCAGAGA AAGAGGAC-3′。PCR反應總體積25 μL，包括1×PCR緩沖液，2.0 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，引物10 pmoL，Ex Taq酶0.5 U，DNA模板25 ng，去離子水加至25 μL，所有試劑均為大連寶生物公司產品。PCR擴增反應在熱循環儀(Bio-Rad)上完成，擴增參數：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用限制性內切酶Eco81Ⅰ于37 ℃消化12 h，通過3%瓊脂糖凝膠電泳分帶確定基因型。為了確保基因分型的準確性，本研究抽取約10%的樣本進行測序驗證。此外，對于用PCR-RFLP無法區分基因型的樣本，也采取DNA測序的方法確定基因型。DNA測序在上海生工北京測序部完成。

1.4 血漿TGF-β1測定 復查CAG前從肘靜脈取血10 mL置于EDTA抗凝管中，1 500 r/min離心15 min，取血漿分裝于2 mL的Eppendorf管中，置于-70 ℃保存待測；標本收齊后用酶聯免疫吸附試驗測定血漿TGF-β1水平，試劑盒由美國Bionewtrans Pharmaciutical Biotechnology Co.Ltd生產；試劑盒檢測線性范圍為0.25～40.00 μg/L，敏感度為0.03 μg/L，嚴格按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 ISR組與NISR組患者一般情況比較 兩組患者年齡、性別、體質量指數(BMI)、空腹血糖、血脂、冠心病家族史、既往高血壓、糖尿病、吸煙史、臨床表型、左心室射血分數、術后藥物治療比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；同時兩組靶血管部位、病變血管支數和靶病變的類型、靶病變長度、支架類型、支架長度、置入支架前后靶血管狹窄程度、參照血管直徑及最小管腔直徑、早期獲得、最大球囊釋放壓力、球囊與血管直徑比值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 TGF-β1基因-509C/T多態各基因型臨床資料比較 TGF-β1基因-509C/T多態各基因型攜帶者年齡、性別、BMI、空腹血糖、血脂、冠心病家族史、既往高血壓、糖尿病、吸煙史、臨床表型、左心室射血分數、術后藥物治療、靶血管部位、病變血管支數和靶病變類型、靶病變長度、支架類型、支架長度、置入支架前后靶血管狹窄程度、參照血管直徑及最小管腔直徑、早期獲得、最大球囊釋放壓力、球囊與血管直徑比值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各基因型復查CAG相關指標比較 見表1。TGF-β1基因-509C/T多態各基因型攜帶者PCI術后復查CAG發現，各基因型參照血管直徑比較差異無統計學意義(P>0.05)；管腔直徑狹窄率比較，-509TT基因型攜帶者狹窄程度明顯增加，其次為-509CT基因型攜帶者，最后為-509CC基因型攜帶者，但差異無統計學意義(P>0.05)；-509TT基因型攜帶者再狹窄發生率、遲發管腔徑丟失、晚期管腔丟失指數最高，其次為-509CT基因型，最后為-509CC基因型，上述指標各基因型比較差異有統計學意義(P<0.05)；-509TT基因型攜帶者最小管腔直徑低于-509CT基因型攜帶者，-509CT基因型攜帶者最小管腔直徑又低于-509CC基因型攜帶者，三者之間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 TGF-β1基因-509C/T多態性分析 見表2。ISR組和NISR組TGF-β1基因-509C/T多態位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡規律，提示兩組人群均有較好的代表性。TGF-β1基因-509C/T多態位點的3種基因型(CC、CT、TT)和等位基因(C、T)分布頻率ISR組和NISR組差異有統計學意義(P<0.05)，TT基因型和T等位基因ISR組所占比例顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，CC基因型及C等位基因ISR組所占比例顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 TGF-β1基因-509C/T多態性與ISR相關性 以CC基因型為參照，通過Logistic回歸分析矯正年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、非ST段抬高型心肌梗死、不穩定性心絞痛、多支病變、左心室射血分數、靶病變部位、靶病變類型、靶病變長度、術前參照血管直徑及靶血管狹窄程度、支架類型、支架數量及長度、置入支架后即刻管腔直徑、釋放壓、術后服藥情況等混雜因素，結果顯示，CC基因型(OR=1.82，95%CI=1.34～4.51，P=0.031)及T等位基因(CT+TT基因型)攜帶者(OR= 1.61，95%CI=1.07～3.79，P=0.043)是PCI術后ISR的危險因素(表3)。

表1 各基因型復查CAG相關指標比較

表2 ISR組和NISR組TGF-β1基因-509C/T多態基因型分布和等位基因頻率[n(%)]

表3 TGF-β1基因-509C/T多態不同基因型與再狹窄發病風險的關聯[n(%)]

注：-表示無數據。

表4 ISR組和NISR組TGF-β1基因-509C/T多態不同基因型血漿TGF-β1水平比較

注：與同組CC基因型比較，△P<0.05；與同組CT基因型比較，*P<0.05；與NISR組比較，★P<0.05。

2.6 血漿TGF-β1水平與ISR發生的關系 見表4。ISR組血漿TGF-β1水平明顯高于NISR組，差異有統計學意義(P<0.05)。以是否發生支架術后再狹窄為因變量，以患者一般情況、靶血管病變情況、支架情況、術后服藥情況、血化驗指標、TGF-β1血漿水平、TGF-β1基因型為自變量，行二分變量Logistic回歸分析，結果顯示，TGF-β1血漿水平是ISR發生的危險因素(OR=2.01，95%CI=1.25～5.34，P=0.016)。

2.7 TGF-β1基因-509C/T基因型對血漿TGF-β1水平的影響 見表4。ISR組和NISR組TT基因型和CT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平差異有統計學意義(P<0.05)，和CC基因型攜帶者差異無統計學意義(P>0.05)；不論是ISR組還是NISR組，TT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平均高于CT和CC基因型攜帶者，差異均有統計學意義(P<0.05)，CT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平均高于CC基因型攜帶者，差異均有統計學意義(P<0.05)，各基因型攜帶者血漿TGF-β1水平組內比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

冠狀動脈支架的出現標志著冠心病的治療進入了一個新的里程碑，但是ISR逐漸成為制約支架技術發展的瓶頸。目前的研究表明，血管內皮功能失調和血管平滑肌細胞(VSMCs)在多種細胞因子的刺激下發生表型改變、遷移、增殖并產生大量的細胞外基質是ISR發生機制的重要環節[5]。動物試驗表明，TGF-β1可以通過多種途徑影響內皮細胞黏附、凋亡及內皮素表達，進而影響損傷后的血管內皮功能[6-7]；同時，TGF-β1可以通過調節成纖維細胞和損傷血管的VSMCs增生，增加細胞間質的合成和分泌，增加細胞外基質和細胞骨架的結合，促進血管重塑[8-9]；抑制TGF-β1的表達可以減少或阻止新生血管內膜的形成和ISR發生[10-11]。在人類樣本中Khan等[12]指出，在冠狀動脈和外周動脈的VSMCs中，TGF-β1水平升高，與原發損傷相比，在PCI術后的再狹窄損傷時TGF-β1水平較高；Chung等在支架術后檢查了人類的再狹窄損傷，發現經皮腔內斑塊旋切術的20條血管中有16條重新回到原來的狀態，行TGF-β1染色時呈陽性表現；同樣，Yutani等檢查了經皮腔內斑塊旋切術冠狀動脈內支架再狹窄后指出，80%的動脈內膜TGF-β1呈陽性表現；Wildgruber等對經皮冠狀動脈腔間血管成形術的患者研究發現，再狹窄患者術后15 min、24 h、2周血漿TGF-β1水平均顯著高于未發生再狹窄的患者。因此，TGF-β1可能在再狹窄過程中發揮很重要的作用。

本研究對368例PCI術后患者的研究發現，ISR組血漿TGF-β1水平顯著高于NISR組，Logistic回歸結果顯示，高血漿TGF-β1水平是ISR發生的危險因素。這可能與PCI術后高水平的TGF-β1促進血管內皮細胞功能紊亂，促進VSMCs遷移、增殖，增加細胞外基質的合成，使新生內膜過度增生和血管重塑，促使再狹窄形成有關。

TGF-β1基因多態性與冠心病關系的報道較多，但迄今少有TGF-β1基因多態性與ISR關系的研究報道。目前研究發現，TGF-β1基因至少存在9個單核苷酸多態性位點，其中位于TGF-β1基因轉錄起始位點上游負性調控區的-509C/T多態(rs1800469)被證明可以引起TGF-β1基因的轉錄和表達改變，從而參與多種疾病的發生和發展。本研究結果顯示，TGF-β1基因-509C/T多態基因型及等位基因頻率在ISR組和NISR組分布差異有統計學意義(P<0.05)，TT基因型和T等位基因攜帶者再狹窄程度顯著高于CC基因型攜帶者，TT基因型和T等位基因攜帶者是PCI術后ISR的獨立危險因素。不論是ISR組還是NISR組，TT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平均顯著高于CC和CT基因型攜帶者，CT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平又顯著高于CC基因型攜帶者；ISR組與NISR組TT基因型和CT基因型攜帶者血漿TGF-β1水平存在差異，由此提示T等位基因與較高的血漿TGF-β1水平有關。這可能與-509C/T多態性位于TGF-β1基因啟動子區轉錄起始位點上游負性調控區，-509位點C→T的基因變異可能通過改變啟動子與轉錄因子的親合力，增強啟動子的活性，影響TGF-β1基因轉錄及翻譯效率，進而上調TGF-β1的蛋白表達有關。

本研究人群中再狹窄患者比例占41.3%，明顯高于以往報道的再狹窄率(15%～30%)，這與本研究的患者來源有關。入選患者多為接受冠狀動脈介入治療后再次出現癥狀后來診，隨后接受冠狀動脈造影復查，與無論有無癥狀均于介入治療后6個月到1年接受造影復查者相比，再狹窄的可能性更高。通過既往對于E-selectin SER129ARC多態性與再狹窄相關性研究分析，這種差異并不會影響研究結果[13]。另外，由于本研究同時納入了置入金屬裸支架和藥物支架的患者，可能會對結果造成一定的困擾，畢竟金屬裸支架和藥物支架ISR的發病機制是不一樣的。此外，本研究病例數較少，一定程度上降低了研究的把握度，易使研究結果產生偏倚，但是為未來的研究探索指明了方向。

總之，本研究發現，在中國重慶地區漢族人群中高血漿TGF-β1水平對預測PCI術后ISR有重要意義，ISR基因-509C/T多態性TT純合子和T等位基因攜帶者在冠狀動脈支架置入術后再狹窄危險性較高。

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Study on association between TGF-β1 and restenosis of coronary stenting*

HUANGJi1，WANGFeng-ming1，HUANGJie1，TANGSu-qiong1，LIUZhu2，YIYuan-xue2，WANGXu-kai3，PEIFang1△

(1.DepartmentofCardiology,ChongqingCorpsHospitalofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Chongqing400061,China;2.CenterofScientificResearchandTeaching,ChongqingCorpsHospitalofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Chongqing400061,China;3.DepartmentofCardiology,ChongqingInstituteofCardiovascularDiseases,ResearchInstituteofFieldSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To explore the association between TGF-β1 gene C-509T single nucleotide polymorphism(SNP) and plasma levels of TGF-β1 with the occurrence of coronary stent restenosis after percutaneous coronary intervention(PCI) in Han nationality crowd.Methods 368 patients with successful coronary stent placement and follow-up angiography were retrospectively included and divided into the in-stent restenosis (ISR) group (n=152) and non in-stent restenosis (NISR) group (n=216).Genotyping for the C-509T polymorphism was performed by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis.Plasma TGF-β1 levels were detected with the enzyme linked immuno sorbent assay(ELISA).Results The prevalence of the TT genotype,frequency of the T allele and the concentration of TGF-β1 in the ISR group were significantly higher than those in the NISR group.The C-509T polymorphism was also significantly correlated with TGF-β1 levels with the TT genotype corresponding with the highest and the CC genotype with the lowest TGF-β1 levels in both ISR and NISR group.The TT genotype,T allele carriers and plasma TGF-β1 levels were significantly associated with the risk of ISR (adjustedOR=1.82,1.61,2.01,P<0.05).Conclusion Higher plasma levels of TGF-β1,TT homozygotes and T allele carriers of TGF-β1 C-509T polymorphism have higher risk of ISR after coronary stenting.

coronary artery diseases; transforming growth factor-β1; single nucleotide polymorphisms; stents; coronary restenosis

國家自然科學基金資助項目(81200193,81370367)。

黃驥，男，博士，副主任醫師，主要從事冠心病和高血壓的防治。

△通訊作者,E-mail：gypeifang@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.001

A

1672-9455(2015)09-1179-04

2014-11-03

2015-02-10)