長春西汀對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用*

孔曉君，王曉梅，高 鑫，李建遠(.寧夏醫科大學檢驗學院,銀川 750004；.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 64005;3.煙臺毓璜頂醫院中心實驗室，山東煙臺 64004)

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長春西汀對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用*

孔曉君1，王曉梅1，高 鑫2，李建遠3△(1.寧夏醫科大學檢驗學院,銀川 750004；2.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005;3.煙臺毓璜頂醫院中心實驗室，山東煙臺 264004)

目的 探討長春西汀對小鼠腎缺血再灌注(IR)損傷的保護作用及其作用機制。方法 將48只健康小鼠分成假手術組、IR組、長春西汀低劑量干預組和長春西汀高劑量干預組，采用雙側腎蒂夾閉45 min的方法建立小鼠腎IR損傷模型，HE染色后觀察腎臟組織形態學變化，測定再灌注24 h后各組血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平，觀察腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。結果 與假手術組相比，IR組出現腎小管管腔擴張,刷狀緣消失，管腔內有管型等病理改變，血清中SCr、BUN、TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，腎組織SOD活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，MDA水平升高，差異也有統計學意義(P<0.05)；與IR組相比，長春西汀10 mg/kg和20 mg/kg干預可呈劑量依賴性改善腎組織病理損傷，SCr、BUN、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平減少，使腎組織SOD活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 長春西汀可通過抑制炎癥和氧化應激來減輕腎IR損傷。

長春西汀； 腎缺血再灌注損傷； 炎癥因子； 氧化應激

腎缺血再灌注(IR)是一常見的臨床問題，腎移植、腎部分切除術、腎部分血管成形術、休克復蘇等均可造成不同程度的腎IR損傷，是造成急性腎衰竭和移植腎功能恢復延遲的主要原因。其病理損傷機制比較復雜，主要涉及氧化應激、炎癥因子的釋放和細胞凋亡等[1]。長春西汀是從夾竹桃科小蔓長春花提取的生物堿，臨床上一直用于缺血性腦血管疾病的治療和預防，它在腦、肝等IR損傷中的保護作用已被報道，但其在腎IR的作用還是未知的[2-3]。本研究旨在探討長春西汀在腎IR損傷中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性昆明白小鼠，體質量30～40 g(濱州醫學院動物實驗中心)。長春西汀注射液購自山東瑞陽制藥有限公司。小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6 酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自達科為生物技術有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白水平測定試劑盒購自煙臺賽爾斯生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型制備 將小鼠分成4組：(1) 假手術組(n=8)；(2)IR組(n=8)；(3)長春西汀低劑量干預組(n=8)；(4)長春西汀高劑量干預組(n=8)。小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥在手術臺上，腹部備皮、消毒后正中切口，游離左右腎蒂，假手術組不夾閉，其余3組分別用無損傷血管夾夾閉，45 min后松開恢復血流，以肉眼觀察腎臟顏色變化來判斷腎臟缺血或再灌注是否成功。長春西汀低劑量和高劑量干預組分別在術前1 h腹腔注射長春西汀10 mg/kg和20 mg/kg；假手術組和IR組同時給予等量生理鹽水。再灌注24 h后打開腹腔，下腔靜脈取血分離血清，取一部分腎組織Bouin氏液固定，剩余腎組織用冰磷酸鹽緩沖液漂洗后-70 ℃保存。

1.2.2 組織學評價 取小鼠腎組織，Bouin氏液固定24 h，常規制備石蠟切片，脫蠟水化后用HE試劑盒染色，光鏡下觀察腎臟的組織形態變化。

1.2.3 血清指標檢測 血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平采用全自動生化分析儀(美國德靈Dimension RXL Max)測定。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.4 腎組織中MDA水平和SOD活性檢測 稱1 g腎組織，放入玻璃勻漿器中，加冷生理鹽水在冰上研磨成10%的組織勻漿，3 000 r/min低溫離心10 min后取上清液，分別按照試劑盒操作步驟對MDA水平和SOD活性進行檢測。蛋白濃度用BCA蛋白水平測定試劑盒檢測。

2 結 果

2.1 腎組織形態學變化 見圖1。HE染色可見假手術組腎小球和腎小管結構正常，發現IR組腎小管排列紊亂，管腔擴張，部分刷狀緣消失；腎小管上皮細胞腫脹，壞死；管腔內可見管型；腎間質炎癥細胞浸潤。長春西汀干預后腎組織病理損傷減輕，其中高劑量干預組損傷改善更顯著，可見腎小管結構完整，排列整齊，管腔內管型減少，炎癥細胞少見。

注：A為假手術組；B為IR組；C為長春西汀低劑量干預組；D為長春西汀高劑量干預組。

2.2 4組腎功能指標變化 見表1。與假手術組相比，IR組SCr和BUN水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；長春西汀干預組SCr和BUN與IR組比較明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；長春西汀高、低劑量干預組SCr和BUN差異也有統計學意義(P<0.05)。

2.3 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6結果比較 見表2。與假手術組相比，小鼠腎IR可引起細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。用長春西汀預處理后，與IR組相比，TNF-α、IL-1β 和IL-6表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，高劑量組降低更顯著，與低劑量組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 腎組織中MDA水平和SOD活性變化 見表3。與假手術組比較，IR組腎組織中MDA水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，SOD活性明顯降低，差異也有統計學意義(P<0.05)；長春西汀低劑量干預組與IR組相比，MDA水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，SOD活性雖有所升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；高劑量干預組與IR組相比，MDA水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，SOD活性升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 4組SCr和BUN結果比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

表2 4組TNF-α、IL-1β、IL-6結果比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

表3 4組MDA和SOD結果比較

注：與假手術組比較，#P<0.05；與IR組比較，*P<0.05；與長春西汀低劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

本研究采用夾閉雙側腎蒂造成腎缺血45 min再恢復血供的方法建立小鼠腎IR損傷模型[4]。術后24 h，IR組小鼠SCr和BUN升高，腎組織病理損傷明顯，提示腎臟IR模型制備成功。給予長春西汀干預后，SCr和BUN水平降低，腎組織病理損傷減輕，由此提示長春西汀干預處理可以改善腎IR損傷程度。

腎IR損傷中有眾多的炎癥介質和免疫因子參與，TNF-α、IL-1β和IL-6表達升高已經成為腎IR炎癥的重要標志[5]。TNF-α是活化單核細胞產生的多活性細胞因子，其能刺激單核巨噬細胞合成和分泌IL-1β和IL-6等炎癥因子[6]。本研究中IR組TNF-α、IL-1β和IL-6表達升高，證明有炎癥參與了組織損傷。長春西汀干預組相對IR組TNF-α、IL-1β和IL-6表達降低，提示長春西汀可以通過抑制炎癥改善腎IR損傷。研究表明，長春西汀作為磷酸二酯酶抑制劑，能夠抑制炎癥相關因子，如核轉錄因子NF-κB和TNF-α的表達，從而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎癥因子的表達，起到保護組織的作用[2,7]。

氧自由基的生成被認為是IR損傷中最重要的發病機制之一[8]。大量氧自由基能夠攻擊細胞膜的脂質和蛋白質，導致脂質過氧化，破壞組織的結構和功能。MDA是脂質過氧化的產物之一，能夠直接反映組織損傷程度[9]。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠保護細胞免受氧自由基的攻擊。本研究中與假手術組相比，小鼠IR后腎臟中MDA水平升高，SOD活性降低，表明腎IR后氧自由基產生增多，損傷了生兒缺血缺氧性腦病預后的影響[J].臨床兒科雜志，2006，24(3)：188-190.

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Protective effect of vinpocetine on mice renal ischemia-reperfusion injury*

KONGXiao-jun1,WANGXiao-mei1,GAOXin2,LIJian-yuan3△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan,Ningxia750004,China;2.SchoolofLifeScience,YantaiUniversity264005；3.CentralLaboratory,YantaiYuhuangdingHospital,Yantai,Shandong264004,China)

Objective To investigate the protective effect and mechanism of vinpocetine in renal ischemia-reperfusion injury.Methods Forty-eight healthy male mice were randomly divided into the sham operation group,ischemia-reperfusion (IR) group,low dose and high dose(10 mg/kg and 20 mg/kg) vinpocetine pretreatment groups.The renal ischemia-reperfusion injury models were established by clamping bilateral renal pedicle for 45 min.The renal morphology changes were observed by the HE staining.The Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 levels at 24 h after reperfusion were detected.The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) contentrations were determined.Results Compared with the sham operation group,the pathological changes in the IR group were tubular dilatation,loss of brush border and casts in lumen.The levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β and IL-6 in the IR group were significantly increased(P<0.05).The SOD activity of kidney tissue was significantly decreased and the MDA contentration was increased,the differences were statistical significant(P<0.05);compared with the IR group,vinpocetine10 mg/kg and 20 mg/kg could improve the pathological injury of renal tissue in a dose-dependent manner,the levels of Scr,BUN,TNF-α,IL-1β,IL-6 and MDA were decreased and the SOD activity was increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion Vinpocetine can ameliorate the renal ischemia-reperfusion injury in mice by inhibiting inflammation and oxidative stress.

vinpocetine; renal ischemia reperfusion; inflammatory factor; oxidative stress

國家自然科學基金(31071262)。

孔曉君，女，碩士,初級檢驗技師，主要從事腎缺血再灌注損傷機制研究。

△通訊作者，E-mail：sdsclj@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.002

A

1672-9455(2015)09-1183-02

2014-11-29

2015-01-20)