阿托伐他汀對高糖誘導的系膜細胞凋亡的影響*

朱 丹，胡 瑩，趙 欣，馬吉芳，郝建兵，任連生，崔 蕾(.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腎內二病房 50070；.黑龍江省醫院血液透析中心，哈爾濱 5000)

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阿托伐他汀對高糖誘導的系膜細胞凋亡的影響*

朱 丹1，胡 瑩1，趙 欣2，馬吉芳1，郝建兵1，任連生1，崔 蕾1(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腎內二病房 150070；2.黑龍江省醫院血液透析中心，哈爾濱 150001)

目的 探討不同濃度阿托伐他汀對大鼠系膜細胞凋亡的影響。方法 體外培養大鼠永生系膜細胞，分為5組：對照(C)組；高糖(30 mmol/L)(H)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 組。采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細胞凋亡。采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測系膜細胞caspase-3活性。結果 與C組相比，H組系膜細胞凋亡率明顯增加，caspase-3活性明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05)。與H組相比，高糖加不同濃度阿托伐他汀組細胞凋亡率明顯降低，caspase-3活性明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且呈濃度依賴。結論 阿托伐他汀可以通過caspase途徑抑制醛固酮誘導的大鼠系膜細胞凋亡。

阿托伐他汀； 高糖； 系膜細胞； 凋亡； caspase-3

糖尿病腎病(DN)的特點為早期出現微量蛋白尿，后期出現大量蛋白尿，嚴重DN可發展成尿毒癥。由于DN的嚴重致殘性，越來越多的學者開始致力于對其機制進行研究。Abboud[1]研究發現，大鼠腎臟系膜細胞的凋亡與蛋白尿的多少關系密切。因此本研究推斷系膜細胞的凋亡參與了DN的發生和發展。Danesh和Kanwar[2]研究發現，他汀類藥物除了具有降脂作用外，還具有其他方面的作用，如抗氧化應激作用，調節細胞周期，減少炎癥等。本研究擬探討他汀類藥物對高糖誘導系膜細胞凋亡的影響，從而揭示DN發生的分子機制，深入探討阿托法他汀保護腎臟的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 系膜細胞由上海長征醫院梅長林教授贈送；阿托伐他汀為美國輝瑞公司生產的立普妥；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒由北京寶賽生物公司生產；caspase-3活性檢測試劑盒由碧云天生物技術研究所生產。

1.2 分組 對照 (C) 組,高糖(30 mmol/L)(H)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 組。各組細胞加藥后培養24 h。

1.3 檢測方法

1.3.1 caspase-3活性檢測 按碧云天caspase-3試劑盒說明書中步驟，迅速測定caspase-3的酶活性。

1.3.2 流式細胞術檢測系膜細胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI雙染法將樣本中正常、壞死、凋亡細胞區分開。采用的判定標準為:左上象限PI(+)、AnnexinV(-)表示壞死細胞區;左下象限PI(-)、AnnexinV(-)表示活細胞區；右上象限PI(+)、Annexin V(+)表示凋亡晚期或死亡細胞區;右下象限PI(-)、AnnexinV(+)表示早期凋亡細胞區。

2 結 果

阿托伐他汀對caspase-3活性和系膜細胞凋亡率的影響 見表1。與C組相比，H組caspase-3活性明顯增高，為(16.29±1.01)%，差異有統計學意義(P<0.05)，H+A1組為(12.37±1.02)%，H+A2組為(9.25±0.92)%，H+A3組為(6.26±0.45)%，均較H組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且呈濃度依賴。C組阿托伐他汀對系膜細胞凋亡率為(2.71±0.24)%,H組為(20.05±0.21)%，H+A1組為(16.45±0.45)%，H+A2組為(12.31±0.33)%，H+A3組為(7.25±0.73)%。高糖可以誘導系膜細胞凋亡，而阿托伐他汀可以抑制系膜細胞凋亡，且其作用呈濃度依賴。

表1 各組caspase-3活性和系膜細胞凋亡率比較

注：與C組相比，*P<0.05；與H組相比，#P<0.05；與H+A1組相比，△P<0.05；與H+A2組相比，▲P<0.05。

3 討 論

細胞凋亡可能會引起系膜細胞減少，增加尿蛋白漏出，從而最終導致腎小球硬化[3];而腎小管萎縮、腎間質纖維化，可以由腎小管上皮細胞凋亡引起，造成尿蛋白加重，最終損害腎功能[4]。近些年，隨著人們對腎臟細胞凋亡研究的不斷深入，發現細胞凋亡與DN的發生和發展密切相關。

許多學者研究表明，他汀類藥物可以減少尿蛋白排泄，延緩糖尿病患者腎小球濾過率下降，減少腎小球硬化速度，從而延緩DN的進展，起到腎臟保護作用[5]。

Zhou 等[6]研究發現，阿托伐他汀可以通過減少線粒體融合蛋白2的表達來抑制心肌缺血大鼠心肌細胞的凋亡。Nam 等[7]研究發現，瑞舒伐他汀可以通過smad依賴性通路及smad非依賴性通路減少環孢素腎病模型大鼠腎臟細胞的凋亡，抑制炎癥，減輕腎臟纖維化。Ishibashi等[8]研究表明，普伐他汀可以通過減少晚期糖基化終末產物受體，從而抑制近端腎小管細胞凋亡。Copaja 等[9]研究發現，辛伐他汀可以通過Rho依賴機制誘導心肌成纖維細胞凋亡。Lavi等[10]研究發現，內皮祖細胞在高膽固醇豬的腎臟中可以凋亡，但辛伐他汀可以減少高膽固醇血癥引起的細胞凋亡，從而減少腎臟損傷，起到腎臟保護作用。Cormack-Aboud等[11]研究發現，瑞舒伐他汀可以通過P21依賴性抗凋亡通路抑制足細胞凋亡，從而減少足細胞損傷，減少尿蛋白，保護腎臟。Lin 等[12]研究發現，辛伐他汀可以通過調節Wnt 信號通路抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡。Bussolati等[13]研究表明，他汀類藥物可以減少氧化低密度脂蛋白誘導的細胞凋亡，也可以減少腎小球足細胞膜裂空蛋白丟失，其作用可能是通過Akt通路實現的。

本研究發現，高糖作用于腎小球系膜細胞引起凋亡的同時，可引起caspase-3活性增加，表明高糖是通過活化caspase引起系膜細胞凋亡的，而阿托伐他汀可以通過抑制caspase活化減少系膜細胞凋亡，且隨著阿托伐他汀濃度增加，其抑制高糖誘導的系膜細胞凋亡作用逐漸加強。

綜上所述，本研究結果顯示，高糖引起caspase-3活化，從而誘導大鼠系膜細胞凋亡，而高糖的上述作用可以被阿托伐他汀所抑制，且呈濃度依賴性。

[1]Abboud HE.Mesangial cell biology[J].Exp Cell Res,2012,318(9):979-985.

[2]Danesh FR,Kanwar YS.Modulatory effeets of HMG-CoA reduetase Inhibitors in diabetic microangiopathy[J].FASEB J，2004，18(7):805-815.

[3]Schiffer M，Bitzer M,Roberts IS，et al.Apoptosis in podocytes indued by TGF-beta and Smad7[J].J Clin Invest，2001，108(6):807-816.

[4]Sugiyama H，Kashihara N，Makino H,et al.Apoptosis in glomerular selerosis[J].Kidney Int，1996，49(1):103-111.

[5]Heart Protection Study Collaborative Group.MRC/BHF heart protection study of ch-olesterol lowering with simvastatin in 20,536 high-risk individuals:a randomized placebo-controlled trial [J].Lancet,2002，360(9326):7-22.

[6]Zhou W,Chen L,Chen M.Atorvastatin inhibits cardiomyocyte apoptosis via down-cegulation the expression mitofusin 2 after myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2014,30(4):388-390.

[7]Nam HK,Lee SJ,Kim MH,et al.Rosuvastatin attenuates inflammation,apoptosis and fibrosis in a rat model of Cyclosporine-Induced nephropathy[J].Am J Nephrol,2013,37(1):7-15.

[8]Ishibashi Y,Yamagishi S,Matsui T,et al.Pravastatin inhibits advanced glycation end products (AGEs)-induced proximal tubular cell apoptosis and injury by reducing receptor for AGEs (RAGE) level[J].Metabolism,2012,61(8):1067-1072.

[9]Copaja M,Venegas D,Aránguiz P,et al.Simvastatin Induces Apoptosis by a Rho-dependent mechanism in cultured cardiac fibroblasts and myofibroblasts[J].Toxicol Appl Pharmacol,2011,255(1):57-64.

[10]Lavi R,Zhu XY,Chade AR,et al.Simvastatin decreases endothelial progenitor cell apoptosis in the kidney of hypertensive hypercholesterolemic pigs[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(5):976-983.

[11]Cormack-Aboud FC,Brinkkoetter PT,Pippin JW,et al.Rosuvastatin protects against podocyte apoptosis in vitro[J].Nephrol Dial Transplant,2009,24(2):404-412.

[12]Lin CL,Cheng H,Tung CW,et al.Simvastatin reverses high glucose-induced apoptosis of mesangial cells via modulation of Wnt signaling pathway[J].Am J Nephrol,2008,28(2):290-297.

[13]Bussolati B,Deregibus MC,Fonsato V,et al.Statins prevent oxidized LDL-induced injury of glomerular podocytes by activating the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT-signaling pathway[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(7):1936-1947.

Effect of atorvastatin on apoptosis of hyperglycemia induced mesangial cells in rat*

ZHUDan1,HUYing1,ZHAOXin2,MAJi-fang1,HAOJian-bing1,RENLian-sheng1,CUILei1

(1.SecondDepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospitalofHaerbinMedicalUniversity,Haerbin,Heilongjiang,150070,China;2.HemodialysisCenterCenter,HeilongjiangProvincialHospital,Haerbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To investigate the influence of different concentrations of atorvastatin on apoptosis of rat mesangial cells.Methods Rat immortal mesangial cells were cultured in vitro and divided into 5 groups:control(C) group,hyperglycemia (30 mmol/L,H)group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-7mmol/L)(H+A1) group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-6mmol/L)(H+A2)group and hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-5mmol/L)(H+A3)group.Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining,and the caspase-3 activity was assayed by the caspase-3 activity kit.Results Compared with the group C,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the group H were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Compared with the group H,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the H+A1,2,3 groups were significantly decreased,the differences were statistically significant(P<0.05),moreover which showing the concentration dependence.Conclusion Atorvastatin may inhibit aldosterone induced mesangial cells apoptosis via caspase pathway.

atorvastatin; high glucose; mesangial cells; apoptosis; caspase-3

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12521293)。

朱丹，女，博士，副主任醫師，主要從事糖尿病腎病腎纖維化研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.007

A

1672-9455(2015)09-1196-02

2014-11-11

2015-01-25)