Innovance測定血漿D-二聚體的分析性能評價*

白著曉，劉慧敏，姜宏兵，鄧朝暉，梁學立，張 新△(1.石河子大學醫學院，新疆石河子 83000；.新疆生產建設兵團醫院/石河子大學醫學院第二附屬醫院檢驗科，烏魯木齊 83000)

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Innovance測定血漿D-二聚體的分析性能評價*

白著曉1,2，劉慧敏2，姜宏兵2，鄧朝暉2，梁學立2，張 新2△(1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.新疆生產建設兵團醫院/石河子大學醫學院第二附屬醫院檢驗科，烏魯木齊 830002)

目的 評價Innovance測定血漿D-二聚體的分析性能。方法 參照美國臨床和實驗室標準化協會文件及相關文獻，對Innovance在Sysmex CA1500凝血分析儀上檢測D-二聚體的精密度、攜帶污染率、準確度、分析測量范圍、臨床可報告范圍上限及參考值進行評價。以一套Sysmex CA1500檢測系統為目標系統，以mini-VIDAS和另一相同Sysmex CA1500檢測系統為比對系統，對目標系統和比對系統檢測D-二聚體結果進行比對及偏倚評估。結果 質控品和混合血漿批內與室內精密度結果均符合廠家聲明要求。攜帶污染率符合要求。測定不同濃度賦值參考物質的準確度試驗，平均偏倚-0.80%～1.28%。驗證的分析測量范圍0.20～4.34 mg/L FEU。臨床可報告范圍上限70.4 mg/L FEU。40例表面健康人群的90百分位數為0.53 mg/L FEU。與mini-VIDAS檢測系統比對，相關系數(r)=0.905，結果間差異有統計學意義(P<0.05)，均值處相對偏倚21.37%。與另一相同Sysmex CA1500檢測系統比對，r=0.996，cut off值處的預期偏倚-4.82%。Sysmex CA1500檢測系統能準確檢測Innovance配套質控品和校準品的D-二聚體，而檢測mini-VIDAS配套的質控品和校準品D-二聚體的偏倚不在允許范圍。同樣，mini-VIDAS檢測系統也只能準確檢測相配套的質控品和校準品。結論 Innovance測定血漿D-二聚體的分析性能符合臨床要求，同一實驗室D-二聚體測定應在相同的檢測系統上完成。

D-二聚體； 免疫比濁法； 性能評價

D-二聚體(D-D)是交聯纖維蛋白在纖溶系統作用下產生的可溶性降解產物，其水平增高提示機體內存在血栓形成和繼發性纖溶亢進[1-2]。研究表明，血漿D-D水平聯合臨床可能性評價在靜脈血栓栓塞癥(VTE)的排除性診斷中具有重要意義[3-4]。目前，臨床實驗室普遍采用免疫比濁法測定血漿D-D水平，但是不同廠家的試劑性能存在很大差異，測定結果的可比性也較差[5-6]。Innovance是一種由西門子醫療診斷公司生產的可以配套用于Sysmex系列凝血分析儀定量測定血漿D-D的試劑，其原理為顆粒增強型免疫比濁法。為深入了解Innovance檢測血漿D-D的分析性能及特點，作者參照美國臨床和實驗室標準化協會文件及相關文獻，在1臺Sysmex CA1500凝血分析儀上對該試劑進行了全面性能評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測系統組成 目標系統(Y):Sysmex CA1500凝血分析儀、Innovance試劑盒及其配套質控品和校準品；比對系統1(X1)：mini-VIDAS免疫分析儀、VIDAS Dimer試劑盒(酶聯免疫熒光法)及其配套質控品和校準品；比對系統2(X2):另1臺Sysmex CA1500凝血分析儀，試劑、質控品和校準品同Y。

1.2 試劑 (1)Innovance試劑盒(批號:560167)及配套4個批號的質控品和3個批號的校準品(賦值參考物質)。Innovance C1、C2、C3 和C4批號分別為560753、560654、560761和560662；Innovance S1、S2和S3批號分別為560569、560559和560578。(2)VIDAS Dimer試劑盒(批號：1002872390)及配套2個批號的質控品和1個批號的校準品(賦值參考物質)。VIDAS C1、C2批號分別為1072880、1072890；VIDAS S批號為1069250。

1.3 血漿標本 來源于新疆生產建設兵團醫院就診患者和健康體檢者，參照《全國臨床檢驗操作規程》(第3版)，用3.2%枸櫞酸鈉抗凝真空管采集2 mL靜脈血，3 000 r/min離心15 min，排除溶血、脂血、黃疸及污染標本。

1.4 方法

1.4.1 D-D測定 嚴格按照Innovance和VIDAS Dimer試劑說明書規范流程測定D-D。測定標本前進行質量控制，整個評價過程使用同一批次的試劑。

1.4.2 精密度試驗 溶解Innovance C1和C2，制備D-D低值P1和高值P2混合血漿標本，均分裝后冷凍保存。按照EP15-A2文件[7]提供的方案，對上述質控品和混合血漿，每日測定1批，每批重復測定4次，連續測定5 d，計算批內精密度(CV批內)和室內精密度(CV室內)，并與廠家聲明的CV批內和CV室內比較。

1.4.3 攜帶污染試驗 取P2高值(H)和P1低值(L)混合血漿進行測定，測定順序及結果記錄如下：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、L5、L6、L7、L8、H4、H5、L9、H6、L10、H7、H8、L11。選出高值對低值(H～L)干擾組(L4、5、9、10、11)與低值對低值(L～L)干擾組(L2、3、6、7、8)兩組數值，分別計算均值M與標準差s，要求[M(H～L)-M(L～L)]<3s(L～L)[8]。

1.4.4 準確度試驗 參照EP15-A2文件[7]，取Innovance S1、S2和S3分別重復測定3次，測定結果與相應靶值比較，計算平均偏倚。

1.4.5 分析測量范圍驗證 參照EP6-A文件[9]，取接近廠家聲明分析測量范圍下限(0.19 mg/L FEU)的低濃度(L)和接近廠家聲明分析測量范圍上限(4.4 mg/L FEU)的高濃度(H)新鮮血漿標本，按1L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、1.0H配比方法，制備6種不同濃度的混合標本，每個標本重復測定3次。設定實驗室的重復性和線性允許誤差范圍均為5.0%，進行數據多元線性回歸分析，對二次多項式非線性系數b2和三次多項式非線性系數b2、b3與0比較進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，以確定最佳擬合方式。

1.4.6 臨床可報告范圍上限驗證 參照EP6-A文件[9]，取3份接近廠家聲明線性范圍上限濃度的患者血漿標本，用配套稀釋液按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋，計算稀釋回收率。回收率在90%～110%為可接受。臨床可報告范圍上限=最大稀釋倍數×分析測量范圍上限。

1.4.7 參考值驗證 參照C28-A3文件[10]，選擇40例表面健康體檢者標本，男、女各20例，年齡18～65歲，計算均值、標準差及90百分位數。廠家聲明參考值：表面健康人群90百分位數為0.55 mg/L FEU。

1.4.8 檢測系統間比對和偏倚評估 (1)參照EP9-A2文件[11]，每天收集患者6～9份新鮮血漿標本，分別在Y和X上按標本編號正向測定一次，再反向測定一次，連續測定5 d，共計40份血漿標本。結果統計：①組內、組間離群值檢驗。②做散點圖和偏倚圖。③計算線性回歸方程和相關系數(r)。④檢測系統間的系統誤差，如r<0.975，使用配對t檢驗進行分析，并計算Y和X檢測結果均值處的平均偏倚；如r≥0.975，計算在cut off值(Innovance和VIDAS Dimer均為0.5 mg/L FEU)處Y與X之間檢測結果的預期偏倚。(2)使用Innovance和VIDAS Dimer配套質控品、校準品，分別在Y和X上進行D-D測定，結果與其相應賦值進行比較。

2 結 果

2.1 精密度試驗結果 盡管2個批號質控品和2個水平混合血漿的CV批內和CV室內均大于廠家聲明的CV批內和CV室內，但均小于相應的驗證值，見表1。

表1 Innovance測定D-D精密度試驗結果

2.2 攜帶污染試驗結果 M(H～L)-M(L～L)=0.018 mg/L FEU，3s(L～L)=0.047 mg/L FEU。

2.3 準確度試驗結果 Innovance S1、S2和S3的D-D測定結果與靶值平均偏倚分別為1.28%(0.64%～1.71%)、-0.80%(-1.59%～2.19%)和-0.11%(-3.80%～2.19%)。

2.4 分析測量范圍驗證結果 重復測量誤差為2.59%,小于5.00%的設定誤差。多項式回歸分析表明，非線性系數b2、b3與0比較差異均無統計學意義(P>0.05)，最佳擬合方式為一次多項式(圖1)，線性回歸方程為Y=0.826 9X-0.595 1,r2=0.998 3，驗證的分析測量范圍為0.20～4.34 mg/L FEU。

圖1 相對濃度水平與實測均值散點圖

2.5 臨床可報告范圍上限驗證結果 3份血漿標本1∶16稀釋后的回收率均可接受，臨床可報告范圍上限為70.4 mg/L FEU。稀釋回收試驗結果見表2。

表2 稀釋回收試驗結果

注：-表示無數據。

2.6 參考值驗證結果 40例表面健康人群D-D測定均值0.29 mg/L FEU，標準差0.15 mg/L FEU，90百分位數為0.53 mg/L FEU，數據呈偏態分布。

圖2 X1測定均值對Y測定均值散點圖(X1-Y)

圖3 X2測定均值對Y測定均值散點圖(X2-Y)

圖4 Y與X1二者測定均值與二者均值差值偏倚圖

圖5 Y與X2二者測定均值與二者均值差值偏倚圖

2.7 檢測系統間比對和偏倚評估結果 經離群值檢驗，方法內、方法間無離群值。X與Y測定結果的散點圖和偏倚圖見圖2～5。Y與X1回歸方程：Y=1.178X1+0.063，r=0.905，結果差異有統計學意義(P<0.05)，均值處的相對偏倚為21.37%。Y與X2回歸方程：Y=0.993X2-0.021，r=0.996，cut off值處的預期偏倚為-4.82%(95%CI0.44～0.52 mg/L FEU)。Y和X只能準確檢測各自配套質控品和校準品的D-D，而檢測對方配套質控品和校準品D-D的偏倚均不在允許范圍，見表3。

表3 Innovance和VIDAS Dimer配套質控品、校準品分別在Y和X上測定D-D結果(mg/L FEU)

3 討 論

D-D是血栓形成的敏感性標志物，假陽性率高、特異性低，但陰性預期值極高[5]。因此，血漿D-D對于排除VTE的診斷頗具價值而在臨床上得到廣泛應用。D-D檢測方法多樣，有酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集法及免疫比濁法，即使同種測定方法其檢測試劑和儀器亦不盡相同[12]。由于國際上尚無統一的單克隆抗體和校準品，不同儀器和試劑測定結果可比性差是D-D測定存在的最大問題[2]。實驗室選擇恰當的D-D檢測方法及掌握所選方法的分析性能和特點對于在VTE患者排除診斷時降低臨床風險至關重要。

Innovance屬于第2代免疫比濁試劑，當其與配套的凝血儀(Sysmex和BCS系列)檢測血漿D-D時，具備快速、高敏感的特點[13-14]。Innovance定量測定血漿D-D(cut off值：0.50 mg/L FEU)可輔助臨床排除VTE的診斷已通過美國食品與藥品監督管理局(FDA)的認證。基于上述原因，作者所在實驗室選擇了Innovance試劑和配套的Sysmex CA1500凝血儀用于患者標本D-D常規檢測。

對Innovance進行精密度評價顯示，測定質控品和混合血漿批內精密度和室內精密度均低于廠家的聲明，但按照EP15-A2文件的驗證要求，測定的CV值均小于驗證值，說明測定的精密度符合廠家聲明的要求，能夠滿足臨床要求。畢波和呂元[15]認為，在進行方法學評價試驗方案設計時，應首先完成精密度試驗和標本攜帶污染試驗，檢測系統的良好重復性和無攜帶污染是進行其他方法學評價試驗的前提。Innovance及其配套的Sysmex CA1500有較低的攜帶污染率。采用3個不同濃度賦值參考物質對Innovance進行測量準確度評估，平均偏倚均可接受。

廠家聲明的分析測量范圍是0.19～4.40 mg/L FEU，作者驗證的范圍為0.20～4.34 mg/L FEU，最高值在廠家提供上限值的±10%以內，故可以接受。Innovance廠家提供的最低檢出限(LOD)為0.05 mg/L，由于D-D如此低值對臨床的意義不大，故作者未對Innovance的最低檢出限和功能靈敏度進行評價，也就未對其臨床可報告范圍的下限進行評估。臨床可報告范圍要結合功能靈敏度、最大稀釋度及分析測量范圍進行確定，在分析測量范圍上限濃度附近的3份標本的最大稀釋度均為1∶16可接受，因此臨床可報告范圍的上限是70.4 mg/L FEU。驗證的稀釋度高于Innovance廠家設置的1∶8稀釋度(廠家臨床可報告范圍上限為35.2 mg/L FEU)，若將儀器的自動稀釋設置到1∶16，可將測定范圍提高至70.4 mg/L FEU。驗證的表面健康人群90百分位數D-D值略低于廠家聲明的參考值，說明廠家的參考區間基本適合于作者所在醫院的就診人群。

將Innovance與mini-VIDAS進行比對發現，相關性不良(r=0.905),二者測定結果差異有統計學意義(P<0.05)，均值處的相對偏倚為21.37%。無論是免疫比濁法還是酶聯免疫吸附試驗，D-D測定均是基于單克隆抗體對D-D抗原表位進行特異性識別[12]。兩種方法同時檢測Innovance與mini-VIDAS配套的質控品和校準品結果可比性差，表明Innovance和mini-VIDAS單克隆抗體及抗體識別的抗原表位不同。在Innovance配套的2臺Sysmex CA1500凝血分析儀上進行的比對試驗發現，2套相同的檢測系統測定結果相關性好(r=0.996)，cut off值處的預期偏倚為-4.82%。因此，作者建議同一實驗室D-D測定應在相同檢測系統上完成，避免因不同檢測系統間測定結果的差異而引起不必要的臨床風險。

總之，Innovance在Sysmex CA1500凝血分析儀上定量測定血漿D-D的各項分析性能指標能夠滿足臨床需求。不同檢測系統的血漿D-D測定結果存在差異，同一實驗室血漿D-D檢測應在相同檢測系統上完成。

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本研究cTnI結果不確定度為2倍SR。即在95%置信水平下為(0.218±0.016)μg/L。

移動差值控制圖評估不確確定度基于“top-down”的原理，通過控制圖保證實驗室內的長期穩定性和統計受控。與不確定度定義“合理地”相一致。控制圖評估不確度是將日常質控工作與不確定度評定有機結合，具有廣闊的應用前景。然而，臨床實驗室使用本法評估cTnI不確定度應注意以下幾點：(1)cTnI校準前應對測量系統進行全面保養，校準后控制品測量值應在“靶值”附近，即系統偏移可忽略，如控制品偏離“靶值”則應重新校準。通過嚴格校準使測量系統過程受控，從而盡量消除系統誤差。(2)必須使用均勻性和穩定性良好的控制品。(3)統計時必須剔除離群值。

運用日常質控數據繪制移動極差控制圖可進行不確定度評估，值得臨床實驗室嘗試。目前，臨床實驗室運用控制圖評定cTnI不確定度的瓶頸是控制品溯源性及測量濃度不能滿足實驗室的需求，因此研究與人血清具有相同基質效應cTnI控制品對臨床實驗室評估不確定度具有重要意義。

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Evaluation of analytic performances of Innovance assay for detecting plasma D-dimer*

BAIZhu-xiao1,2,LIUHui-min2,JIANGHong-bing2,DENGZhao-hui2,LIANGXue-li2,ZHANGXin2△

(1.MedicineSchoolofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory，HospitalofXinjiangProductionandConstructionCorps/SecondAffiliatedHospital,MedicineSchoolofShiheziUniversity,Wulumuqi,Xinjiang830002,China)

Objective To evaluate the analytical performance of Innovance assay for detecting plasma D-Dimer.Methods Referring to the documents of Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI) and the related literatures,the performances of Innovance for detecting plasma D-dimer on the Sysmex CA 1500 analyzer were evaluated,including precision,carryover contamination rate,accuracy,analytical measurement range,upper limit of clinical reportable range and reference value.With the Sysmex CA 1500 as the objective detection system and the mini-VIDAS and another same Sysmex CA 1500 detection system as the reference detection system,the detection results of D-dimer by these systems were perfromed the comparison and bias estimation.Results The within-run precisions and within-laboratory precision of control materials and pooled plasma samples conformed to those of manufacturer statement.The carryover contamination rate was in accord with the clinical requirement.The average deviation of Innovance assay for detecting different calibrators were -0.80%～1.28%.The verified analytical measurement range was 0.20～4.34mg/L FEU.The upper limit of clinical reportable linear range was 70.4mg/L FEU.The 90th percentile in 40 cases of apparently healthy adults was 0.53mg/L FEU.When the test results of the objective detection system were compared with those of mini-VIDAS system (r=0.905),there were significant difference(P<0.05) and the relative bias in the point of mean value was 21.37%.When the test results of the objective detection system were compared with those of another Sysmex CA1500 (r=0.996),the expected bias in the point of cut-off value was -4.82%.D-dimer concentration of Innovance′s control materials and calibrators can be accurately detected by the Sysmex CA1500,but the detection results of the mini-VIDAS′s control materials and calibrators by the Sysmex CA1500 can not be accepted.Similarly,the D-dimer concentration of the mini-VIDAS′s control materials and calibrators could only be accurately detected by the mini-VIDAS detection system.Conclusion The performance of Innovance assay for detecting plasma D-dimer conforms to clinical requirement,and the D-dimer test at the same laboratory should be accomplished in the same detection system.

D-dimer; immunoturbidimetric assay; performance evaluation

兵團科技局重點科技攻關項目(2013BA018)；兵團醫院院級課題項目(YJ2014002)。

白著曉，男，碩士，主要從事檢驗項目的方法學評價及其在疾病診療中作用的研究。

△通訊作者，E-mail：zjq010902@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.013

A

1672-9455(2015)09-1211-04

2014-11-05

2015-01-18)