3株導管相關血流感染鮑曼不動桿菌同源性分析*

孫恒彪，陳佑明，張 婧，潘祖漢，謝俊杰(南方醫科大學第三附屬醫院檢驗科，廣州 510630)

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3株導管相關血流感染鮑曼不動桿菌同源性分析*

孫恒彪，陳佑明△，張 婧，潘祖漢，謝俊杰(南方醫科大學第三附屬醫院檢驗科，廣州 510630)

目的 對分離自同一患者不同血流部位的3株鮑曼不動桿菌進行同源性分析，在基因水平上明確中心靜脈導管相關血流感染的實驗室診斷，為臨床防治提供依據。方法 采用西門子Microscan Walkaway 40 Plus微生物鑒定及藥敏系統對分離的3株鮑曼不動桿菌進行細菌鑒定及藥敏分析，應用腸桿菌科基因組間重復序列聚合酶鏈反應(ERIC-PCR)及瓊脂糖凝膠電泳進行同源性分析。結果 3株鮑曼不動桿菌ERIC-PCR均擴增出陽性產物，3株細菌均電泳出13條位置相同的條帶。結論 3株鮑曼不動桿菌屬于相同的基因型，ERIC-PCR可用于鮑曼不動桿菌的同源性分析。

中心靜脈導管； 導管相關血流感染； 鮑曼不動桿菌； 同源性

隨著醫療技術的不斷進步與發展，越來越多的侵入性操作用于臨床疾病的診斷與治療，其中中心靜脈導管穿刺術是一種臨床最常用的治療手段。通過中心靜脈導管可以進行高滲及強刺激藥物輸注、血液透析、營養支持治療及動態監測血流動力學，可以避免多次外周靜脈穿刺，減少患者痛苦，還可以避免化療藥物外滲，減少因化療藥物引起的靜脈炎[1]。但是隨著中心靜脈導管的廣泛使用，中心靜脈導管引起的導管相關血流感染(CRBSI)在普通病房及重癥監護病房(ICU)均有發生，不僅增加患者醫療支出及住院時間，而且給患者造成極大的痛苦，甚至威脅患者生命[2-3]。本次調查通過分析分離自同一患者外周血、中心靜脈導管血及中心靜脈導管尖端3株鮑曼不動桿菌同源性，查找分析造成此次CRBSI的可能原因，加深對CRBSI診療的認識，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者，女，84歲，因“反復胸悶、胸痛10年，再發伴頭暈、頭痛7 d”收入本院心內科。4月26日為了建立靜脈輸液通路，監測中心靜脈血壓，行經鎖骨下中心靜脈穿刺置管術。5月7日12:00左右患者出現發熱，體溫38.3 ℃，隨即分別從中心靜脈導管及右上肢抽取靜脈血進行血培養，結合患者臨床表現經驗給予靜脈滴注頭孢曲松(CRO)，當晚19:00左右中心靜脈導管血細菌培養報陽性，涂片結果為革蘭陰性桿菌，立即拔除導管并送檢做導管尖端細菌培養及鑒定，5月8日01:00左右右上肢靜脈血細菌培養報陽性，涂片結果為革蘭陰性桿菌。5月10日中心靜脈導管血、右上肢靜脈血及中心靜脈導管尖端培養結果均為鮑曼不動桿菌，中心靜脈導管尖端鮑曼不動桿菌半定量計數結果為20 cfu。5月11日患者體溫恢復正常。

1.2 質控菌株 大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)均由廣東省臨床檢驗中心提供。

1.3 細菌鑒定及藥敏試驗 采用西門子公司的Microscan Walkaway 40 Plus型微生物鑒定及分析系統對分離得到的3株鮑曼不動桿菌進行鑒定及藥敏試驗。藥敏試驗采用微量肉湯稀釋法，藥敏試驗抗菌藥物選擇哌拉西林(PIP)、四環素(TET)、替卡西林/克拉維酸(TIM)、頭孢他啶(CAZ)、CRO、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、美羅培南(MEM)、阿米卡星(AMK)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、環丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、復方磺胺甲噁唑(SXT)14種藥物。藥敏試驗結果以美國臨床和實驗室標準化協會指南文件2010版作為藥敏試驗判斷標準。

1.4 細菌基因組DNA提取 于血平板上挑取單個菌落加入到含500 μL雙蒸水的Eppendorf離心管中，12 000 r/min離心20 s，棄上清液，重復上述步驟洗滌細菌2次，最后棄上清液加入500 μL雙蒸水，每管再加入10 mg/mL的蛋白酶K 10 μL，混勻58 ℃溫浴60 min，取出離心管放入95 ℃水浴箱中水浴10 min后立即冰浴20 min，12 000 r/min離心1 min，取上清液作為聚合酶鏈反應(PCR)模板。

1.5 腸桿菌科基因組間重復序列(ERIC)-PCR反應體系 引物序列為ERIC2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，由上海生工生物工程有限公司提供[4-5]。PCR反應體系：總體積40 μL，其中雙蒸水20 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，引物2.0 μL，模板2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，MgCl26 μL。

1.6 PCR擴增 ERIC-PCR采用羅氏cobas TaqMan 48型PCR儀進行，ERIC-PCR反應條件[6]：先94 ℃變性5 min；后92 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，70℃延伸1 min，共計35個循環；最后再70 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳：采用德國Biometra Compact M電泳儀進行電泳，4 μL擴增產物加1 μLLoading Buffer，共5 μL加入到1.2%瓊脂糖凝膠中，電壓80 V、電泳3 h。采用英國Uvitec Firereader凝膠成像儀對凝膠進行拍照。采用Quantity One V4.62版本對電泳結果進行聚類分析。

2 結 果

2.1 3株鮑曼不動桿菌耐藥性分析 中心靜脈導管血、右上肢靜脈血及中心靜脈導管尖端分離得到的3株鮑曼不動桿菌生物編碼均相同，對臨床常用抗菌藥物敏感性較好。3株鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物敏感性見表1。

表1 分離自導管靜脈血、右上肢靜脈血及導管尖端3株鮑曼不動桿菌耐藥性分析

注：S表示敏感。

2.2 同源性分析 分離得到的3株鮑曼不動桿菌采用ERIC-PCR進行同源性分析，ERIC-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，電泳結果見圖1。PCR擴增產物條帶數量、位置完全相同為同一基因型；主條帶相同，副條帶相差1～2條為基因型相似或密切相關；不符合上述條件者為不同基因型。電泳結果顯示，3株鮑曼不動桿菌擴增產物條帶數均為13條且位置相同，故認為3株鮑曼不動桿菌為同一基因型。聚類分析結果見圖2。

注：1為中心靜脈導管血；2為右上肢靜脈血；3為中心靜脈導管尖端。

圖1 3株鮑曼不動桿菌ERIC-PCR電泳結果

注：#1為中心靜脈導管血；#2為右上肢靜脈血；#3為中心靜脈導管尖端。

圖2 3株鮑曼不動桿菌聚類分析結果

3 討 論

CRBSI是臨床一種常見的院內感染，引起CRBSI的常見病原菌有凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、真菌等，鮑曼不動桿菌已成為引起臨床科室尤其是ICU的CRBSI的重要病原菌[7-9]。本次調查通過采用ERIC-PCR在基因水平對鮑曼不動桿菌引起的CRBSI給予確認，ERIC-PCR具有應用廣泛、簡便、快速、敏感性高及重復性好等特點，可用于細菌鑒定、分類及流行病學調查[10]。隨著各種各樣導管在臨床上的使用，CRBSI時有發生，引起CRBSI有多種多樣的原因，常見相關因素有：(1)導管類型及材料。雙腔及多腔導管均可增加CRBSI發生的概率；聚乙烯材質的導管因細菌易定植，可使CRBSI發生率上升。(2)導管穿刺部位。鎖骨下靜脈感染率大于頸靜脈，頸靜脈感染率大于股靜脈。(3)敷料的選擇。臨床常用半透性聚氨酯敷貼可造成皮膚局部潮濕，增加細菌定植及感染概率。(4)導管留置時間。導管留置時間超過7 d是引起CRBSI的一個重要危險因素。(5)醫護人員操作熟練程度。盲穿、穿刺時間過久、操作生疏等均可增加CRBSI的發生率。(6)患者因素。高齡、腫瘤、血液病、重癥感染、創傷、營養不良、病情復雜、病程長，以及復雜大手術等均是CRBSI的易感因素[11]。在本次調查中，該患者送檢的中心靜脈導管血培養報陽時間為4.5 h，右上肢靜脈血報陽時間為11.8 h，比中心靜脈導管血報陽時間晚7.3 h，中心靜脈導管血及右上肢靜脈血培養結果均為鮑曼不動桿菌，拔除的中心靜脈導管尖端也培養出了鮑曼不動桿菌，3株鮑曼不動桿菌藥敏試驗結果完全形同，對常用抗菌藥物均敏感。依據CRBSI判斷標準[12]：導管尖端培養陽性計數大于或等于15 cfu，中心靜脈導管血陽性報警時間比外周血報警時間早2 h以上，該患者可確診為CRBSI，同時ERIC-PCR同源性分析結果在基因水平也顯示該患者發生了CRBSI。該患者病情十分復雜，合并多種疾病：(1)冠心病、穩定型心絞痛；(2)高血壓；(3)慢性支氣管炎、慢性膽囊炎及慢性胃炎；(4)右腎切除術后、慢性腎衰竭、高鉀血癥；(5)5年前闌尾炎穿孔闌尾及直腸切除，乙狀結腸造口術后；(6)骨質疏松；(7)輕度貧血。結合上述，高齡、病情復雜、病程長、復雜大手術等均可能是造成該患者此次CRBSI的原因，但不能排除其他因素。

由于中心靜脈導管的廣泛使用及易發生CRBSI的特性，這就要求在日常工作中嚴格無菌操作，組織醫護人員進行培訓，規范導管操作技術，提高導管護理水平，每天更換敷貼，對導管進行肝素化，防止血栓形成，根據病情及時拔除導管，積極治療原發疾病，伴有復雜疾病的老年人做好支持治療，提高患者免疫力[13]。同時，在懷疑CRBSI時應及時送檢血培養及導管尖端細菌培養，為臨床診斷及治療提供依據。

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Analysis on homology of 3 strains of Acinetobacter bnaumannii in catheter-related bloodstream infection*

SUNHeng-biao，CHENYou-ming△，ZHANGJing，PANZu-han，XIEJun-jie

(DepartmentofClinicalLaboratory,ThirdAffiliatedHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510630,China)

Objective To analyze the homology of 3 strains of Acinetobacter baumannii isolated from different bloodstream positions in the same patient for definiting the laboratory diagnosis of central venous catheter-related bloodstream infection at the gene level to provide the basis for clinical prevention and treatment.Methods 3 strains of Acinetobacter baumannii were identified and the drug sensitivity was performed by using Microscan Walkaway 40Plus microbiological idetification and drug susceptibility system(Sienems,German).The homogeneous genotyping was performed by using enterobacteria repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) and Agarose gel electrophoresis.Results The positive products were amplified from 3 strains of Acinetobacter baumannii.13 bands with the same location appeared by electrophoresis.Conclusion 3 strains of Acinetobacter baumannii belong to the same genotype.ERIC-PCR can be used in the homology analysis of Acinetobacter baumannii.

central venous catheter; catheter-related bloodstream infection; acinetobacter baumanni; homology

廣東省廣州市科技計劃項目(2012Y5-00004)。

孫恒彪，男，本科，主管檢驗師，主要從事臨床微生物檢驗。

△通訊作者,E-mail:cym38432@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.014

A

1672-9455(2015)09-1215-03

2014-11-15

2015-01-18)