3種實驗技術在多發性骨髓瘤檢測中的應用

蘆 晗，王志銀，李 強△(.新鄉醫學院，河南新鄉 453000;.新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉 45300)

?

3種實驗技術在多發性骨髓瘤檢測中的應用

蘆 晗1，王志銀2，李 強2△(1.新鄉醫學院，河南新鄉 453000;2.新鄉醫學院第一附屬醫院，河南新鄉 453100)

目的 評估形態學、免疫組化和流式細胞檢測技術在多發性骨髓瘤(MM)檢測中的應用價值。方法收集新鄉醫學院第一附屬醫院2013年9月至2014年5月MM患者30例，采用免疫組化和流式細胞術分析骨髓瘤細胞免疫表型，探討其表達率與骨髓瘤細胞形態特征及相關檢測指標的關系。3種檢測方法組間差異采用配對樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗。結果 形態學檢測瘤細胞比例在6.00%～95.00%，免疫組化檢測瘤細胞比例在9.00%～88.00%，流式細胞檢測瘤細胞比例在4.07%～87.42%。形態學與免疫組化、形態學與流式細胞之間差異有統計學意義(P<0.05)，免疫組化與流式細胞之間差異無統計學意義(P>0.05)。結論 流式細胞術、免疫組化與形態學3種技術相結合，更有助于MM的診斷及預后判斷。

多發性骨髓瘤； 流式細胞術； 免疫組化； 形態； 免疫表型

多發性骨髓瘤(MM)是以B細胞起源，骨髓中惡性漿細胞(瘤細胞)異常增生和聚集為特征的一種衰竭性、難以治愈的惡性腫瘤，并伴有單克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白)增多。MM好發于40歲以上中老年人群，近年來，隨著我國人口老齡化加劇，MM發病率逐年上升。由于在疾病早期其臨床表現無特異性，極易出現誤診和漏診[1-2]。本文通過免疫組化、流式細胞術對傳統骨髓細胞形態學診斷的30例MM進行細胞免疫表型分析，并比較3種檢測方法之間的差異，以期為MM的早期診斷及療效判斷提供更可靠的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集新鄉醫學院第一附屬醫院2013年9月至2014年5月MM患者30例，初診26例，復查4例；其中男17例，女13例，男∶女=1.31∶1；年齡43～78歲，中位年齡64歲。均符合《血液病診斷及療效標準》的診斷標準[1]。初診患者均進行骨髓穿刺、血清免疫固定電泳、流式細胞術及影像學等相關檢查。

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀為BD FACSCalibur，鼠抗人CD38、CD45、CD138、CD19、CD56、胞漿lambda(clambda)、胞漿kappa(ckappa)，破膜劑、溶血素，以上試劑均購自美國BD公司。免疫組化一抗用鼠抗人CD138、Kappa輕鏈、lambda輕鏈單克隆抗體，抗體購自河南賽諾特生物公司，二抗用Haopoly-HRP鼠/兔通用二抗試劑盒購自上海杰浩生物技術有限公司。細胞形態學檢測用瑞氏染液、免疫組化復染用蘇木素染液，均由本室配制。

1.3 方法

1.3.1 標本留取 按常規方法行骨髓穿刺，取骨髓液0.2 mL涂片做形態學和免疫組化檢測；另抽取2 mL置于肝素抗凝管做流式細胞學檢測，調整細胞濃度至1×106/L備用，48 h內完成檢驗。

1.3.2 骨髓細胞形態學檢查 挑選涂片良好的骨髓片行瑞氏染色，顯微鏡下觀察并分類計數200個有核細胞，以漿細胞大于或等于20%并伴形態異常為MM的診斷標準[1]。

1.3.3 免疫組化染色 (1)染色步驟：取新鮮干燥的骨髓涂片，血膜周圍用免疫組化筆畫圈以避免抗體流失，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min，滴加封閉血清置室溫孵育10 min，甩干，分別滴加適量一抗(CD138、Kappa、lambda)，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加適量二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色3～10 min，鏡下觀察，見有明顯棕色沉淀為宜，自來水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片、鏡檢。每次試驗均進行陰性對照。(2)陽性結果判斷：在低倍鏡下找尋涂片均勻、薄厚適中、抗原表達明顯的部位，高倍鏡下細胞膜、胞漿或胞核顯示棕黃色均勻細顆粒為陽性表達，CD138、lambda陽性位于胞膜或胞漿，Kappa陽性位于胞漿，陰性為不顯色或顯色淺淡。油鏡下計數200個有核細胞，分別計算各抗體陽性細胞所占比例，以10%以上者為陽性。

1.3.4 流式細胞儀分析 按說明書提供的細胞表面抗原和胞內抗原方法標記，經熒光微球校準儀器及補償后,用Cell Quest分析軟件獲取20 000個細胞，對數取樣，通過CD45和CD38/SSC設門設定待檢細胞群，分析各群細胞抗原表達情況。以目的細胞群抗原表達大于10%為陽性。

1.4 觀察指標 所有病例確診時的年齡、性別、臨床表現、血紅蛋白(Hb)、清蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、血清鈣濃度(Ca)、β2微球蛋白(β2-MG)、紅細胞沉降率(ESR)、血清及尿液免疫固定電泳、尿本周蛋白(BJP)等各項檢查結果逐一記錄并進行回顧性分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS20.0軟件處理，率的比較用χ2檢驗，均數組間差異用配對樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 形態學檢查 26例初診患者均有不同程度的正色素性貧血及免疫球蛋白增多，其中IgG型19例，IgA型7例。骨髓細胞形態學結果主要為異常漿細胞增生，并伴有質的改變。另外4例復查患者形態學檢查均未達到完全緩解。

2.2 免疫組化結果 30例MM患者CD138陽性表達率達到100.0%，22例Kappa陽性，8例lambda陽性(表1)。

2.3 流式細胞檢查結果 對目的細胞群抗原CD38、CD138、CD19、CD45、Kappa、lambda進行研究，結果發現,30例MM中CD19陰性表達率100.0%；CD45表達異常(陰性、部分陽性)；CD38、CD138陽性表達率均達到100.0%(表1)。

表1 免疫組化和流式細胞術在30例MM異常漿細胞抗原表達形式比較[n(%)]

注：-表示無數據。

2.4 3種檢測方法比較 30例MM患者形態學檢查骨髓瘤細胞中位數比例為58.00%(6.00%～95.00%)，免疫組化檢測比例為34.55%(9.00%～88.00%)，流式細胞檢測比例為35.74%(4.07%～87.42%)。對3種方法檢測到的異常細胞群所占比例進行分析，形態學與免疫組化和流式細胞分析測定的異常細胞群比例細胞檢查之間差異有統計學意義(P<0.05)，免疫組化與流式細胞檢查之間差異無統計學意義(P>0.05)。另外形態學與流式細胞術之間有更好的相關性(r=0.957)。

2.5 免疫組化與流式細胞檢查診斷敏感性比較 30例MM患者免疫組化結果陽性28例，陽性率為93.3%(28/30)，流式細胞檢查結果陽性27例，陽性率為90.0%(27/30)，兩種方法差異無統計學意義(χ2=0.215，P>0.05)。

2.6 輕鏈限制性檢測 30例MM進行流式檢測Kappa限制性表達22例，lambda限制性表達8例。

2.7 CD138抗原與實驗室檢測指標的關系 30例MM患者中CD138的表達與臨床實驗室檢測指標(C反應蛋白、BUN、Ca、ALB、β2-MG，ESR)的改變之間差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

MM在我國發病率約為1/10萬，在血液系統腫瘤發病率僅次于惡性淋巴瘤[3]。在實驗室檢測中，骨髓形態學檢測是MM診斷最基礎、最普遍的檢測手段，在一定程度上可以反映治療效果。但骨髓瘤細胞常呈灶狀分布，臨床上為了提高診斷陽性率需要進行多次骨髓穿刺，并且當骨髓稀釋時也影響診斷敏感性[4]；在鑒別診斷時主觀性強，靈敏度低。然而在多數醫院對于MM診斷仍以形態學為主，使疾病確診及療效判斷都受到不同程度的限制。因此，本試驗采用免疫組化和流式細胞檢查兩種免疫檢測方法彌補形態學診斷的不足。

免疫組化根據抗原抗體特異性結合的原理可以提高診斷的準確性，鑒別良、惡性疾病，以及判斷疾病惡性程度，這點優于傳統形態學檢測。據報道，CD19在所有B細胞和大多數正常漿細胞均有表達，而在MM中不表達[5-6]；CD138在骨髓造血前體細胞和淋巴細胞中無表達，但在MM漿細胞中為陽性，具有相對特異性，便于識別；而CD38在髓系或B淋巴系統前體細胞及成熟淋巴細胞、單核、粒細胞均有不同程度的表達，目前認為CD138是漿細胞最特異的指標[7]。所以本試驗免疫組化選擇CD138聯合Kappa輕鏈、lambda輕鏈單克隆抗體作為識別異常漿細胞的標志物。在30例MM患者中，CD138陽性表達率達100.0%，Kappa陽性率為73.3%，lambda陽性率為26.7%，與血清免疫固定電泳結果一致。

近年來，流式細胞檢測技術日漸成熟，當骨髓稀釋時，流式細胞檢查可以等比降低骨髓漿細胞比例，優于形態學檢測[8]。在正常骨髓中，現代多參數流式細胞儀可以足夠敏感地檢測出至少0.01%的非典型漿細胞，也能對單個細胞進行多個抗原檢測，同時對細胞表面和胞內抗原進行分析，并且對檢測細胞的表達水平可以定量，因此流式細胞檢查可以很好地識別并呈現異常漿細胞各種特征[9-10]。通過檢測細胞表面抗原表達強弱、胞內免疫球蛋白是否有輕鏈限制性及異常抗原的出現，可以把正常和異常漿細胞區分開來。正常漿細胞強表達CD38、CD138，表達CD45，大部分細胞表達CD19，不表達B淋巴系抗原CD20、CD22，無輕鏈限制性。典型MM細胞的免疫表型特點為：異常表達CD56，CD38表達強度稍弱，部分表達CD117、CD33、CD20，不表達CD19，CD45表達弱陽性或陰性，有輕鏈限制性[11]。本試驗中CD138和CD38陽性表達率均為100.0%。CD19均為陰性表達，CD45陰性表達率為93.3%，輕鏈限制性表達，與上述結論基本一致，但其中有2例骨髓涂片和免疫組化均超過10%。而流式細胞檢查未能檢出骨髓瘤細胞，對流式細胞檢查標本涂片鏡檢未見瘤細胞，這可能是由于瘤細胞灶性分布，流式細胞檢查標本不一定采集到骨髓瘤細胞而漏檢；也有可能在采集流式細胞檢查標本時由于技術問題混入較多血液所致。

免疫組化和流式細胞檢查聯合檢測的優勢在于通過lambda/Kappa輕鏈限制性表達確定漿細胞是否為單克隆性，從而與反應性漿細胞增多鑒別，這在區分漿細胞良、惡性方面有重要作用，二者敏感性遠遠高于形態學檢測[12]。對于30例MM患者同時進行形態學、免疫組化和流式細胞檢查檢測得到以下結果：骨髓涂片漿細胞比例與免疫組化、流式細胞檢查分析測定的異常細胞群比例差異有統計學意義(P<0.05)，且形態學與流式細胞檢查之間有更好的相關性(r=0.957)，免疫組化與流式細胞術差異無統計學意義。另外對免疫組化和流式細胞檢查比較分析，兩種方法檢測陽性率均較高(分別為93.3%和90.0%)，差異無統計學意義(P>0.05)，由此說明免疫組化與流式細胞檢查對MM確診都有檢測意義，且均有明顯的lambda/Kappa輕鏈限制性表達，陽性表達率一致，有助于鑒別診斷。

流式細胞檢查和免疫組化在診斷MM方面就靈敏度而言高于傳統的形態學檢測，但不能評判骨髓增生程度及腫瘤浸潤程度，而且國內外少見這兩種方法對MM的診斷標準，導致各實驗室檢測結果存在差異。可根據患者具體情況，采用三者聯合以提高陽性診斷率及療效監測。期待在不久的將來流式細胞檢查技術和免疫組化可以納入MM常規診斷和評估中。

[1]張之南，沈悌.血液病診斷及療效標準[M].3版.北京：科學出版社，2007：232-235.

[2]楊璐，徐俊榮，顧兵.免疫固定電泳技術對多發性骨髓瘤的分型診斷及預后判斷價值[J].檢驗醫學與臨床，2011，8(16)：1975-1976.

[3]田永芳，賈海英，田洪燕.47例多發性骨髓瘤綜合分析[J].臨床血液學雜志:輸血與檢驗版，2010，23(4)：473-474.

[4]徐曉月.兩種不同的骨髓檢驗方法在多發性骨髓瘤診療中的價值[J].檢驗醫學與臨床，2013，10(22)：2998-2999.

[5]Cho YU,Park CJ,Park SJ,et al.Immunophenotypic characterization and quantification of neoplastic bone marrow plasma cells by multiparametric flow cytometry and its clinical significance in korean myeloma patients[J].J Korean Med Sci,2013,28(4):542-549.

[6]姜永芳，戴海濱，董家薔，等.多發性骨髓瘤中骨髓瘤細胞免疫表型檢測及其意義[J].哈爾濱醫科大學學報，2011，45(5)：448-450.

[7]郜曉.多發性骨髓瘤免疫表型流式細胞術研究新進展[J].中國實驗血液學雜志，2011，19(4)：1083-1086.

[8]邢娟娟.30例多發性骨髓瘤的流式細胞分析[J].實用臨床醫學，2013，14(5)：26-27.

[9]de Tute RM,Jack AS,Child JA,et al.A single-tube six-colour flow cytometry screening assay for the detection of minimal residual disease in myeloma[J].Leukemia,2007,21(9):2046-2049.

[10]Rawstron AC,Davies FE,DasGupta R,et al.Flow cytometric disease monitoring in multiple myeloma:the relationship between normal and neoplastic plasma cells predicts outcome after transplantation[J].Blood,2002,100(9):3095-3100.

[11]劉艷榮.實用流式細胞術——血液病篇[M].北京：北京大學醫學出版社，2010：189-190.

[12]曹方方，陳芳，胡延平，等.多參數流式細胞術測定多發性骨髓瘤細胞免疫標記的研究[J].中國實驗血液學雜志，2012，20(3)：620-623.

Application of 3 kinds of experimental techniques in detection of multiple myeloma

LUHan1,WANGZhi-yin2,LIQiang2△

(1.XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China；2.FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453100,China.)

Objective To assess the clinical value of morphology，immunohistochemistry and flow cytometry detection techniques in the diagnosis of multiple myeloma(MM).Methods 30 cases of MM in the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College from September 2013 to May 2014 were collected for this study.The immunohistochemistry and flow cytometry were adopted to analyze the immunophenotyping of MM cells for investigating the relationship between the expression rates and MM cells morphological characteristics with the related detection indicators.Results In the morphology examination,the proportion of myeloma cells was 6.00%-95.00%,which by using immunohistochemistry was 9.00%-88.00% and which by using flow cytometry was 4.07%-87.42%.There were statistical differences between the morphology and immunohistochemistry and between the morphology and flow cytometry(P<0.05),but there was no statistical difference between immunohistochemistry and flow cytometry(P>0.05).Conclusion The combination of flow cytometry,immunohistochemistry and morphology even more conduces to the diagnosis and prognosis judgment of MM.

multiple myeloma； flow cytometry； immunohistochemistry； morphology； immunophenotype

蘆晗，女，在讀碩士，主要從事實驗血液學研究。△

，E-mail：lq19600@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.039

A

1672-9455(2015)09-1278-03

2014-11-13

2015-01-17)