TLR4基因rs4986790和rs4986791位點多態性與幽門螺桿菌感染的研究*

舒 穎，張平安，童永清

(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

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·論 著·

TLR4基因rs4986790和rs4986791位點多態性與幽門螺桿菌感染的研究*

舒 穎，張平安△，童永清

(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

目的 檢測湖北地區人群Toll樣受體4(TLR4)基因rs4986790和rs4986791位點單核苷酸多態性，以及與幽門螺桿菌(Hp)感染的關系。方法 收集2012年12月至2013年6月在武漢大學人民醫院內鏡中心進行胃鏡活檢的就診患者326例，同時采集患者外周血。采用免疫膠體金法檢測患者外周血中Hp抗體。采用等位基因特異性聚合酶鏈反應檢測TLR4基因 rs4986790和rs4986791位點多態性。結果 TLR4 基因rs4986790位點在所有研究對象中基因型均為AA型，TLR4基因rs4986791位點在所有研究對象中基因型均為CC型。結論 湖北地區人群TLR4基因rs4986790和rs4986791位點不存在多態性，湖北地區人群Hp感染與rs4986790和rs4986791 2個位點多態性不存在相關性。

Toll樣受體4基因； 單核苷酸多態性； 幽門螺桿菌

幽門螺桿菌(Hp)是一種多鞭毛、螺旋狀、微需氧的革蘭陰性菌，是人類最常見的慢性感染菌之一，定居在人體胃黏膜表層的黏膜層，感染后不予治療可能會終生定植。1982年Warren和Marshall從人胃黏膜中分離培養出Hp后，經過20多年的研究表明，Hp為慢性活動性胃炎的主要致病菌，是消化性潰瘍的重要致病因素，是胃癌重要的危險因素，世界衛生組織已將其列為一類致癌物[1]。然而，在不同人群中，Hp感染率并不相同，全球Hp感染率大約占50.00%[2-3]，我國自然人群Hp總感染率為56.22%[4]，湖北地區Hp感染率為58.90%[5]。Hp感染除了與所接觸到的細菌數量、細菌毒力及環境因素存在一定的關系外，還可能與宿主本身的遺傳易感性有一定的關系。Toll樣受體4(TLR4)是革蘭陰性細菌脂多糖(LPS)的受體，在LPS誘導的信號轉導途徑中起著重要作用。因此，本文擬探討湖北地區人群中TLR4基因rs4986790和rs4986791位點多態性與Hp感染的關系，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年12月至2013年6月在武漢大學人民醫院內鏡中心進行胃鏡活檢的就診患者326例,男202例，女124例，平均年齡(46.8±6.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集所有研究對象空腹靜脈血3 mL，取1 mL分離出血清，-20 ℃保存備用；2 mL置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝試管中充分混勻，-20 ℃保存備用。

1.2.2 Hp抗體檢測 采用免疫膠體金法檢測Hp抗體，試劑盒由深圳市惠安生物科技有限公司提供，靈敏度92.3%，特異性97.7%。

1.2.3 儀器與試劑 全血基因組DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)，超微量核酸分析儀ND-2000(美國Thermo Scientific公司)，ABI 9700基因擴增儀和DYY-6C電泳儀(北京六一公司)，ABI3130測序儀和測序所用試劑(美國Applied Biosystem公司)。

1.2.4 引物設計 參照Genbank中TLR4基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物。針對單核苷酸多態性(SNP)位點rs4986790設計2對特異性引物，用來鑒別rs4986790基因的3種基因型(GG型、AA型和GA型)。針對SNP位點rs4986791設計2對特異性引物，用來鑒別rs4986791基因的3種基因型(CC型、TT型和CT型)。引物序列見表1。

表1 SNP位點基因多態性擴增引物

1.2.5 基因組DNA提取 采用基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA，操作過程參照試劑盒使用說明書。DNA提取完成后-20 ℃保存備用。

1.2.6 等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)擴增 采用MBI Ferments 2×PCR mix反應液配制PCR擴增體系。rs4986790 PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃ 10 min。rs4986791 PCR擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃ 10 min。整個反應過程在ABI 9700基因擴增儀上完成。

1.2.7 基因型判讀 取10 μL PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統分析rs4986790和rs4986791基因型。對于同一位點，如果僅出現突變型引物擴增產物，則判定該位點為突變型，如果僅出現野生型引物擴增產物，則判定該位點為野生型，如兩種引物均出現擴增產物，則為雜合子。

1.2.8 DNA測序驗證 采取簡單隨機抽樣的方法挑選30份不同基因型的DNA樣本，進行PCR后將擴增產物進行凝膠電泳，回收并純化上述DNA條帶，在ABI3130測序儀上進行測序分析。

2 結 果

2.1 Hp抗體檢測結果 采用免疫膠體金法檢測326例研究對象血清標本，Hp抗體陽性患者有210例，Hp抗體陰性患者116例。

2.2 DNA測序法與AS-PCR檢測rs4986790和rs4986791位點多態性的比較 見圖1、2。以DNA測序法作為金標準，兩種方法檢測的30份標本rs4986790和rs4986791基因型符合率為100%。

2.3 TLR4基因rs4986790和rs4986791位點基因型檢測情況 對326例DNA樣本進行分析，均未發現TLR4基因rs4986790位點和rs4986791位點有突變。即rs4986790多態性位點均為野生型A而未見突變型G，rs4986791位點均為野生型C而未見突變型T(圖3)。

注：A為DNA測序法檢測結果；B為AS-PCR檢測結果。

圖1 DNA測序法與AS-PCR檢測rs4986790基因型結果

注：A為DNA測序法檢測結果；B為AS-PCR檢測結果。

圖2 DNA測序法與AS-PCR檢測rs4986791基因型結果

圖3 TLR4基因rs4986790和rs4986791位點各基因型分布

3 討 論

Toll樣受體家族(TLRs)是近年來發現的在抗病原微生物免疫防御反應中起重要作用的受體蛋白，能通過識別細菌、病毒等病原體的相關模式分子，啟動天然免疫和調節免疫反應，在聯系天然免疫和獲得性免疫中也起橋梁作用。近年來有研究表明，TLR在Hp感染所致胃部炎性反應中起至關重要的作用。迄今，在人類已發現了10個TLRs(TLR1～TLR10)，它們多表達于抗原提呈細胞及上皮細胞[6]。TLR4基因是當前研究最為廣泛的TLRs，其主要配體為細菌LPS、病毒的包膜蛋白等[6]。有研究表明，TLR4能將LPS傳導通路的信號迅速傳至核內，激活核轉錄因子κB通路，刺激一氧化氮分泌，消滅病原；此外，還能激活有關細胞因子表達，釋放促炎細胞因子，激活特異性免疫反應，最終在機體的先天性免疫中起重要作用[7]。

對于TLR4基因rs4986790和rs4986791 2個位點多態性與Hp感染相關性疾病的研究，不同學者有不同的意見。Bagheri等[8]的研究表明，在伊朗人群中，TLR4 基因rs4986790突變能夠增加Hp感染相關性胃炎患病風險；Oliveira和Silva[9]的研究表明，在巴西人群中，TLR4基因rs4986790突變與胃癌有明顯的易感相關性；Santini等[10]在研究意大利人群TLR4基因多態性與胃癌的關系中表明，rs4986791突變能明顯增加胃癌的患病風險；Garza-Gonzalez等[11]報道墨西哥人群中TLR4基因rs4986790和rs4986791的突變均與晚期胃癌的患病無易感相關性。在本研究中，通過對TLR4基因 rs4986790和rs4986791 2個位點的多態性進行檢測，發現326例研究對象中均未發現有上述突變，這與Zheng等[12]和Hang等[13]的研究結果一致。此外，類似的結果在日本人群中也有報道[14]。由此提示上述2個位點等位基因突變在中國人群乃至亞洲人群中可能極少見或者根本沒有突變。這也說明，由于種族和地域差異，TLR4基因rs4986790和rs4986791基因多態性有一定差別，并且與疾病的關系也存在明顯差異。

綜上所述，本研究在湖北地區人群中并沒有檢測到TLR4基因rs4986790和rs4986791位點多態性，TLR4基因rs4986790和rs4986791位點多態性可能與湖北地區人群Hp感染并無相關性。至于TLR4基因其他多態性位點及TLR家族的其他一些基因多態性位點與Hp感染關系還有待進一步研究。

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Research of rs4986790 and rs4986791 single nucleotide polymorphisms in TLR4 and susceptibility of helicobacter pylori infection*

SHUYing，ZHANGPing-an△，TONGYong-qing

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To access the the possible contribution of Toll 1ike receptor 4(TLR4) gene rs4986790 and rs4986791 polymorphism and to define association between TLR4 genotype and susceptibility of helicobacter pylori infection.Methods A total of 326 patients who had been examined by gastroscopy were obtained from the endoscopy center of Renmin Hospital of Wuhan University between December 2012 and June 2013.Immune colloidal gold method was used to testing the serological Hp antibody of all the patients.The TLR4 gene rs4986790 and rs4986791 polymorphisms were examined by alleles specific polymerase chain reaction.Results All the individuals had the same TLR4 rs4986790 genotypes(AA),and all the individuals had the same TLR4 rs4986791 genotypes(CC).Conclusion None polymorphisms of rs4986790 and rs4986791 were detected in Hubei populations,and showed no relationship between TLR4 genotype and susceptibility of helicobacter pylori infection.

Toll like receptor 4 gene； single nucleotide polymorphism； helicobacter pylori

國家臨床重點專科建設項目資助[財社(2010)305號]。

舒穎，女，在讀碩士，主要從事感染性疾病的免疫遺傳學研究。

△通訊作者,E-mail:zhangpingan@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.003

A

1672-9455(2015)03-0295-03

2014-08-20

2014-10-22)