5種結(jié)核桿菌檢測方法的臨床應用價值*

王 震,龔玉華，錢彩娣，孫春紅，王雪梅，施 瑜，周麗萍,傅行禮，邵啟祥

(1.江蘇省鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院檢驗科 212000；2.江蘇省鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院檢驗科 212000；3.江蘇大學醫(yī)學技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

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·論 著·

5種結(jié)核桿菌檢測方法的臨床應用價值*

王 震1,龔玉華2，錢彩娣1，孫春紅2，王雪梅2，施 瑜1，周麗萍3,傅行禮3，邵啟祥3

(1.江蘇省鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院檢驗科 212000；2.江蘇省鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院檢驗科 212000；3.江蘇大學醫(yī)學技術學院，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

目的 比較和分析免疫磁珠捕獲聯(lián)合雙內(nèi)標聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測結(jié)核桿菌技術(IMC-PCR-ELISA)與其他幾種結(jié)核桿菌檢測法在結(jié)核病診斷中的臨床應用價值。方法 以102例結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性的患者作為陽性對照，以48例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性的非結(jié)核普通住院患者作為陰性對照。比較抗酸染色涂片法(AFS)、免疫磁珠-抗酸染色涂片法(IMC-AFS)、金標抗結(jié)核抗體檢測法(DICA)、普通PCR及IMC-PCR-ELISA的敏感性及特異性。結(jié)果 IMC-PCR-ELISA定量檢測結(jié)核分枝桿菌全過程約4.5 h,最低檢測限為5 copy/μL，本法的特異性和敏感性均為100.00%，其他4種(AFS、IMC-AFS、DICA、普通PCR)檢測方法的敏感性分別為35.29%、43.14%、60.78%、93.14%，特異性分別為95.83%、95.83%、75.00%、91.67%。結(jié)論 IMC-PCR-ELISA與AFS、IMC-AFS、DICA及普通PCR相比，具有快速、靈敏、特異、可定量的特點，是臨床快速診斷結(jié)核病的有效檢測方法。

結(jié)核分枝桿菌； 免疫磁珠； 聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附試驗； 檢測方法

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病,是全球最具威脅的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,我國患結(jié)核病人數(shù)居世界第2位，是全世界22個結(jié)核病流行嚴重的國家之一[1]。當前，我國在結(jié)核病控制方面所面臨的問題是結(jié)核病的早期診斷,尤其是痰菌陰性肺結(jié)核的診斷[2]。目前，臨床實驗室常用的結(jié)核桿菌檢測方法有抗酸染色鏡檢法、細菌培養(yǎng)法、抗結(jié)核抗體檢測法及分子生物學檢測法等[3]。其中，痰涂片抗酸染色鏡檢法方法簡單、快速，但敏感性較差,每毫升標本中需5 000～10 000條菌才呈陽性結(jié)果[4]。培養(yǎng)法耗時較長，且不適合一般實驗室開展(P2級以下實驗室不允許做)。血清抗結(jié)核抗體檢測在臨床應用中也存在假陽性和假陰性的問題[5]。近年來，分子生物學技術檢測結(jié)核分枝桿菌，克服了傳統(tǒng)方法的諸多不足，能更快速、敏感、特異地鑒定結(jié)核桿菌感染。本文通過對比分析本室建立的免疫磁珠捕獲聯(lián)合雙內(nèi)標聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測法(IMC-PCR-ELISA)與抗酸染色涂片法(AFS)、免疫磁珠-抗酸染色涂片法(IMC-AFS)、金標抗結(jié)核抗體檢測法(DICA)、普通PCR在結(jié)核病診斷中的臨床應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2010年10月至2013年11月鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院(鎮(zhèn)江市傳染病醫(yī)院)的102例臨床診斷為肺結(jié)核且結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的患者痰標本和血清標本作為陽性對照；選取鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院的48例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性的非結(jié)核普通住院患者的痰標本和血清標本作為陰性對照。質(zhì)控菌株：結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Ra、非結(jié)核分枝桿菌來自鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院(鎮(zhèn)江市傳染病醫(yī)院)；大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、綠膿假單胞菌(ATCC 27853)菌株為本室保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 酸性羅氏培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羥酸肼(TCH) 鑒別培養(yǎng)基、抗酸桿菌染色液均由珠海貝索生物技術有限公司提供。

1.2.2 免疫磁珠 Dynal公司生產(chǎn)的rabbit-IgG Dynabeads磁珠表面結(jié)合結(jié)核分枝桿菌抗體(Abcam公司產(chǎn)品)。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒由南京大淵生物技術工程有限責任公司提供。

1.2.4 PCR試劑盒為日本Takara生物技術有限公司產(chǎn)品；引物、高/低內(nèi)標模板(內(nèi)標模板與 PCR 擴增目的片段等長且與目的模板在引物區(qū)的序列相同)、雜交探針(3′端用地高辛標記)由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.5 主要儀器 Hettich-UNIVERSAL16R 型低溫高速離心機(德國Hettich 公司產(chǎn)品)；Mastercycler Personal 5332型 PCR擴增儀(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)；國產(chǎn) BS-423 型電泳儀(北京生化儀器廠產(chǎn)品)；國產(chǎn) MD-300 型紫外多功能分析儀(鎮(zhèn)江美達生物儀器有限公司產(chǎn)品)。

1.3 方法

1.3.1 標本處理 患者晨痰標本加入等量消化劑,渦旋振蕩30 s,室溫靜置15 min,其間搖動數(shù)次,使痰液完全液化無痰絲。取液化痰液 1 mL 5 000轉(zhuǎn)離心10 min,沉淀加入 0.5 mL pH值7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻；清晨空腹抽取患者外周靜脈血5 mL,分離血清。

1.3.2 分枝桿菌培養(yǎng)及鑒定按照《結(jié)核診斷實驗室檢驗規(guī)程》執(zhí)行。

1.3.3 AFS操作步驟 取處理后的痰標本0.1 mL在玻片右側(cè)2/3處,均勻涂抹成2.0 cm×2.5 cm的卵圓形痰膜,自然干燥后火焰固定,加石碳酸復紅溶液,徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，染5 min,水洗。加脫色劑,不時搖動玻片至無色脫落為止,水洗。加復染液,染0.5～1.0 min,水洗，待玻片干燥后鏡檢。

1.3.4 IMC操作步驟 在處理后的痰標本中加入結(jié)合有結(jié)核桿菌抗體的免疫磁珠 20 μL,置混勻儀上反應 30 min,經(jīng)清洗后收集磁珠,加入0.2 mL ddH2O混勻后備用。

1.3.5 IMC-AFS操作步驟 取捕獲處理后的免疫磁珠0.1 mL，加10 μL小牛血清，混勻后同AFS制片染色，干燥后鏡檢。

1.3.6 DICA操作步驟 按試劑盒說明書操作。

1.3.7 普通PCR操作步驟 取捕獲處理后的免疫磁珠0.1 mL，煮沸10 min,取上清為模板[6]；在PCR反應管中加入10×PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,2.5 mmol/L的 dNTP 4 μL,上、下游引物各 15 pmol(根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復合體群IS61lO序列設計的特異性引物),Taq酶 2 U，模板液2.5 μL。PCR 反應參數(shù)為：預變性94 ℃ 4 min,變性 94 ℃ 35 s,退火 62 ℃ 35 s,延伸 72 ℃ 40 s,共35個循環(huán)，72 ℃ 再延伸 5 min；1%瓊脂糖凝膠，1～5 V/cm，電泳溴酚藍前沿距離凝膠前端1 cm時，切斷電源。置于0.5 μg/mL溴化乙啶水溶液中，室溫下染色20～30 min，自來水沖洗凝膠后，于紫外燈下觀察。

1.3.8 IMC-PCR-ELISA操作步驟 (1) 樣本模板制備同上。(2)在PCR反應管中加入10×PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,2.5 mmol/L的 dNTP 4 μL,上、下游引物各 15 pmol(根據(jù)結(jié)核分枝桿菌復合體群IS61lO序列設計的特異性引物，上游引物的5′端用生物素修飾),Taq酶 2 U，再加入50拷貝數(shù)的低標內(nèi)參模板和10 000拷貝數(shù)的高標內(nèi)參模板及樣本模板2.5 μL，最后加 ddH2O 至 50 μL；PCR 反應參數(shù)為：預變性94 ℃ 4 min,變性 94 ℃ 35 s,退火62 ℃ 35 s,延伸72℃ 40 s,共20個循環(huán)，72 ℃再延伸3 min。(3)從反應后的 PCR管中分別取10 μL到3孔加有100 μL稀釋液(0.01 mol pH7.2 PBS)的鏈霉親和素預包被微孔板中，混勻，放置45 ℃水浴40 min，水洗；(4)加100 μL堿變性液(1.5 mol氯化鈉,0.15 mol氫氧化鈉),37 ℃水浴15 min，加1 mol HEPES 35 μL，混勻后，水洗。(5)在3孔中分別加入100 μL與3種模板對應的探針雜交液(探針溶度為0.05 pmol/μL),放置 45 ℃水浴 40 min，水洗。(6)加50 μL抗DIG酶標記抗體，放置37 ℃ 30 min，水洗，加入底物37 ℃ 15 min，加 50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，5 min內(nèi)酶標儀450 nm測吸光度值，參考波長為630 nm。(7)計算公式為：Y=10X,其中X=lg(低標拷貝數(shù))+(lg(高標拷貝數(shù))-lg(低標拷貝數(shù))×(目的模板吸光度值-低標吸光度值)/(高標吸光度值-低標吸光度值)。

1.3.9 DICA結(jié)果判斷 按試劑盒說明書判斷結(jié)果。

1.3.10 IMC-PCR-ELISA結(jié)果判斷 用酶標儀測量高標內(nèi)參、低標內(nèi)參、目的模板3個檢測孔分別在 450 nm處的吸光度值(參考波長為 630 nm)，再用上述公式計算目的模板的拷貝數(shù)；檢測靈敏度：通過試驗確定，在PCR反應體系中，最佳低標內(nèi)參模板量為 50拷貝數(shù)，高標內(nèi)參模板量為 10 000拷貝數(shù)。通過加入系列不同拷貝數(shù)的目的模板，檢測出本試驗的最低檢測限為 5 copy/μL。陽性質(zhì)控菌株:結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Ra；陰性質(zhì)控菌株:非結(jié)核分枝桿菌、大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、綠膿假單胞菌(ATCC 27853)。

2 結(jié) 果

2.1 普通PCR 245 bp處擴增出目的條帶為陽性結(jié)果，見圖1。

圖1 PCR擴增結(jié)核分枝桿菌IS6110檢測結(jié)果

2.2 5種結(jié)核分枝桿菌檢測方法結(jié)果比較 見表1。

表1 5種方法對150例臨床標本的檢測結(jié)果

2.3 AFS及IMC-AFS結(jié)果判斷 涂片中結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌被染成紅色，其他細菌染成藍色。陽性質(zhì)控菌株:結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Ra；陰性質(zhì)控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922)。

3 討 論

本室建立的采用IMC聯(lián)合IMC-PCR-ELISA，首先通過抗結(jié)核桿菌抗體包被的免疫磁珠，能特異性地捕獲結(jié)核分枝桿菌[7]。這樣既起到了濃縮收集結(jié)核分枝桿菌的作用，又減少了標本中其他細菌對試驗的干擾。然后，在PCR反應體系中加入目的模板和另外2個已知不同溶度的雙內(nèi)標模板，反應后得到3類擴增產(chǎn)物。由于其中一條引物的5′端用生物素進行了標記，生成的3類擴增產(chǎn)物均帶有生物素標記。進一步用鏈霉親和素包被的酶標板捕獲PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)變性解鏈后，用3套特異性探針(3′端用地高辛標記)與擴增產(chǎn)物分別進行雜交。再用抗地高辛酶標記抗體與雜交體上的地高辛結(jié)合,漂洗后加底物顯色,測定吸光度值。最后根據(jù)3種模板起始拷貝數(shù)與檢測的吸光度值呈正比的關系，通過公式計算得到目的模板的起始拷貝數(shù)。

本研究以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法為金標準，將培養(yǎng)結(jié)果為陽性的102例患者的痰標本和血清標本作為陽性對照，以48例培養(yǎng)結(jié)果為陰性的非結(jié)核患者痰標本和血清標本作為陰性對照。對IMC-PCR-ELISA與其他臨床常用的幾種結(jié)核桿菌檢測方法進行了對比分析，結(jié)果顯示，AFS簡單、快速，但敏感性(35.29%)較差，與文獻[8]報道結(jié)果一致；IMC-AFS由于結(jié)合了免疫磁珠捕獲技術，敏感性(43.14%)較AFS高。但上述兩種方法，結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌均顯示陽性，不能有效區(qū)分。DICA檢測的是血清中抗結(jié)核抗體，其敏感性較涂片法高，但由于非結(jié)核患者中因免疫接種等原因會有一定的假陽性結(jié)果出現(xiàn)，本次測試中該法的特異性(75.00%)為5種檢測方法中最低的。普通PCR顯示出較高的敏感性(91.67%)和特異性(93.14%)，但仍出現(xiàn)4例假陽性和7例假陰性，經(jīng)分析其中假陰性結(jié)果為目的模板的拷貝數(shù)較低而導致，假陽性結(jié)果則為非特異性擴增所致。本室建立的IMC-PCR-ELISA定量檢測結(jié)核分枝桿菌方法,通過磁性微粒表面包被抗結(jié)核分枝桿菌抗體，可特異性捕獲結(jié)核分枝桿菌，起到了濃縮收集目的菌和減少干擾的作用，再聯(lián)合PCR檢測技術能顯著提高目的基因的檢出率，其靈敏度要比單獨PCR增加8～2 000倍[9-11]。同時，分子雜交技術的應用，也大大提高了方法的特異性[12]。此外，雙內(nèi)標PCR技術實現(xiàn)了定量檢測目的模板起始拷貝數(shù)的目的。IMC-PCR-ELISA檢測全過程約4.5 h,最低檢測限為5 copy/μL，特異性和敏感性均為100.00%。結(jié)果顯示，IMC-PCR-ELISA具有快速、靈敏、特異、可定量檢測的特點，是臨床快速診斷結(jié)核病的有效檢測方法。

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The clinical value of 5 kinds of mycobacterium tuberculosis detection method*

WANGZhen1，GONGYu-hua2，QIANCai-di1，SUNChun-hong2，WANGXue-mei2，SHIYu1，ZHOULi-ping3，F(xiàn)UXing-li3，SHAOQi-xiang3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangSecondPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangThirdPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China;3.MedicalTechnologyCollegeofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

Objective To analyze and compare the detection method for tuberculosis by immunomagnetic beads capture combined with PCR-ELISA with double internal standard (IMC-PCR-ELISA) and other testing methods，and discuss its clinic application．Methods To tally 102 patients with culture-positive tuberculosis from sputum were used as positive control,48 nontuberculosis inpatients with culture-negative tuberculosis from sputum were used as negative control．And the sensitivity and specificity of smear acid-fast stain (AFS),immune magnetic beads smear acid-fast stain method (IMC-AFS),jinbiao anti-tuberculosis antibody assay (DICA),ordinary PCR and IMC-PCR-ELISA were compared．Results The results showed that the IMC-PCR-ELISA could yield quantitative results within about 4.5 h with a detection limit at 5 copy/μL,the specificity and sensitivity of this method were all 100.00%.The sensitivity of the AFS,IMC-AFS,DICA and ordinary PCR were 35.29%,43.14%,60.78% and 93.14%，while the specificity were 95.83%,95.83%,75.00% and 91.67%,respectively．Conclusion Compared with AFS，IMC-AFS，DICA and ordinary PCR,the IMC-PCR-ELISA is rapid,sensitive,secific and quantitative method for detecting tuberculosis,which can be taken as a helpful method for rapid detection of TB．

mycobacterium tuberculosis； immunomagnetic beads； PCR-ELISA； detection methods

江蘇省鎮(zhèn)江市社會發(fā)展基金資助項目(SH2010019)。

王震，男，本科，副主任技師，主要從事臨床微生物檢驗工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.019

A

1672-9455(2015)03-0334-03

2014-08-24

2014-10-18)