熱療和熱療聯合放療對人食管癌ECA109細胞凋亡的影響

劉桂榮，康亞輝，馬建新，李雪梅

(江蘇省連云港市第二人民醫院腫瘤放療科 222000)

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·論 著·

熱療和熱療聯合放療對人食管癌ECA109細胞凋亡的影響

劉桂榮，康亞輝，馬建新，李雪梅△

(江蘇省連云港市第二人民醫院腫瘤放療科 222000)

目的 研究熱療和熱療聯合放療對人食管癌ECA109細胞凋亡的影響。方法 將人食管癌ECA109細胞分為4組：正常對照組、單純熱療組、單純放療組和熱療+放療組，在熱療聯合不同照射劑量下誘導ECA109細胞凋亡，以流式Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測其凋亡率，蛋白質印跡法檢測細胞內caspase-3、Bax、Bcl-2的表達，克隆集落形成實驗觀察熱療的輻射增敏作用。結果 通過多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，可見熱療+放療組的ECA109細胞存活分數明顯低于單純放療組(P<0.01)，熱療聯合放療可以增加細胞的輻射敏感性，輻射增敏比為1.24；與單純放療組相比，熱療+放療組ECA109細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；相對于單純放療和單純熱療，熱療+放療作用于人食管癌ECA109細胞可以使凋亡相關蛋白caspase-3、Bax的表達明顯升高，Bcl-2表達明顯降低。結論 熱療能夠提高人食管癌細胞的放射敏感性，其機制可能與熱療增加人食管癌細胞的凋亡率密切相關。

熱療； 放療； 食管癌； 放射敏感性

我國是食管癌高發國家，在我國因惡性腫瘤死亡的病例中，食管癌高居第4位[1]。手術雖是治療食管癌的首選方法，但手術的創傷性大，患者術后生活質量較差，并且部分患者因發現較晚而失去手術機會。熱療已經成為繼手術、放療、化療和生物治療之后的第5類治療手段[2]，熱療聯合放療在腫瘤的臨床治療中應用較多，并且臨床療效明顯。包括腫瘤在內的許多疾病的發生是由細胞增殖和凋亡的不平衡造成的[3]，研究表明熱療主要通過促進細胞凋亡而發揮治療腫瘤的作用，caspase-3則是細胞凋亡信號通路中的重要調節分子之一[4]。此外，凋亡的發生受多種基因調控，其中Bcl-2家族在細胞凋亡中的作用備受關注。Bcl-2為凋亡抑制蛋白，Bax為凋亡促進蛋白,兩者形成異二聚體抑制Bcl-2的功能，均與細胞凋亡密切相關[5]。盡管熱療增強腫瘤細胞放射敏感性及誘導腫瘤細胞凋亡的作用已經受到越來越多的重視，但熱療聯合放療對人食管癌ECA109細胞的影響的報道甚少。本研究初步探討熱療聯合放療對人食管癌ECA109細胞凋亡的影響及其機制，為熱療與放療聯合治療食管癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 人食管癌ECA109細胞株均為本科室保存標本。

1.2 儀器與試劑 含10%新生牛血清、胰蛋白酶及完全型RPMI-1640培養基均購自美國Gibco公司；羊抗兔二抗、蛋白質分子量標準、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、TE電泳緩沖液、10×Western轉膜緩沖液、30%Acry-Bis、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl)、過硫酸銨(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)均購自海門碧云天生物技術研究所；Bcl-2兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；caspase-3兔抗人單克隆抗體購自谷歌生物；Bax兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司；GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國Bioworld公司，Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測試劑盒及吉姆薩染液均購自南京凱基生物科技發展有限公司。23EX醫用直線加速器(美國VARIAN公司)，FACS Aria流式細胞儀(美國BD公司)，Mini-PROTEAN4電泳儀(美國Bio-rad公司)，ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 照射及加熱 采用6 MV的X射線垂直照射，源靶距(SSD)100 cm，照射野面積15 cm×20 cm，吸收劑量率為400 cGy/min。恒溫孵育箱，溫度為(43±0.1)℃。

1.3.2 細胞培養與處理 人食管癌ECA109細胞株用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養箱中孵育培養，每2～3天傳代一次。對照組：在37 ℃孵育箱中常規培養；單純放療組：以0、1、2、4、6、8 Gy照射，不同劑量照射后繼續在37 ℃孵育箱中培養；單純熱療組：使用恒溫孵育箱(43±0.1)℃，加熱處理60 min后，再置于37 ℃恒溫箱中；熱療+放療組：照射前于恒溫孵育箱(43±0.1)℃加熱，再按不同照射劑量(0、1、2、4、6、8 Gy)照射后置于37 ℃恒溫箱中繼續培養。

1.3.3 流式細胞術檢測 細胞凋亡和壞死細胞分組處理之后繼續培養24 h，其中單純放療組和熱療+放療組均予以6 Gy照射。收集細胞后用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍后消化離心，重懸計數使其密度大于1×106/mL。取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙錠溶液(PI)混勻后，于室溫避光孵育15 min。于流式細胞儀上檢測，激發波長(Ex)488 nm，發射波長(Em)530 nm，計算凋亡率。

1.3.4 蛋白質印跡法(Western blot)檢測細胞內caspase-3、Bax及Bcl-2表達 細胞分組處理之后于37 ℃孵育箱中繼續培養24 h，其中單純放療組和熱療+放療組均予以6 Gy照射。收集各組細胞，用1×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解不同處理組細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，制作10%分離膠和5%濃縮膠，待其凝固后加入蛋白樣品15 μL。電泳條件：80 V，10 min；120 V，30 min。轉移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，轉膜條件：恒流300 mA，90 min。將轉膜后的PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中1 h，加入特異性一抗(1∶400)于4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，最后加入發光底物經X射線曝光顯示蛋白條帶。重復實驗至少3次。

1.3.5 克隆集落形成實驗檢測熱療的輻射增敏作用 取指數生長期的人食管癌ECA109細胞，以適當密度接種于六孔板中，細胞分組處理后繼續培養，每3天換液1次，當六孔板中出現肉眼可見克隆時(約10 d)，終止培養，棄去上清液，用PBS沖洗3遍，無水甲醇固定10 min，姬姆薩染色15 min，然后用流動水洗去染色液，自然晾干后于倒置顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數。克隆形成率(%)=(對照組克隆數/實驗組細胞數)×100%，存活分數(SF)=實驗組克隆形成率/對照組克隆形成率。根據多靶單擊模型SF=1-(1-e-D/D0)N擬合細胞存活曲線，式中D為放射劑量；D0為曲線指數下降63%所需的劑量，即平均致死劑量；D0=1/k，k為存活曲線斜率；N為外推數，Dq為細胞受損所需的準閾劑量，Dq= D0×lnN。計算輻射增敏比(SER)，SER=D0(對照組)/D0(實驗組)。重復實驗3次。

2 結 果

2.1 熱療對凋亡相關蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，單純放療與單純熱療組人食管癌ECA109細胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表達均上調，說明單純放療、熱療均具有促腫瘤細胞凋亡的作用；而熱療+放療組促凋亡蛋白表達更加明顯，說明熱療聯合放療可以明顯地促進腫瘤細胞的凋亡。然而，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達則截然相反，再次驗證了熱療對放療的增敏效應。見圖1。

圖1 Western blot檢測各組ECA109細胞中

2.2 熱療對人食管癌ECA109細胞放射敏感性的影響 人食管癌ECA109細胞經過處理后，根據單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，計算出熱療+放療組的SER。可見熱療+放療組的SF明顯低于單純放療組，組間比較差異有統計學意義(t=5.659 2，P<0.01)。見圖2。細胞加熱后再受到不同劑量X射線的照射，細胞存活曲線明顯改變，存活曲線的斜率增大，D0值下降，SER為1.24，說明熱療具有明顯的輻射增敏作用。見表1。

圖2 不同處理組ECA109細胞存活曲線圖

組別kND0DqSF2SER單純放療0.312.663.232.150.87-熱療+放療0.512.691.961.660.701.24

注：SF2為單次照射2 Gy的SF；-表示無數據。

2.3 不同處理組人食管癌ECA109細胞流式結果 熱療+放療組ECA109細胞凋亡率明顯高于單純熱療組(P<0.05)和單純放療組(P<0.05)，說明熱療與X射線聯合作用有增加食管癌細胞凋亡的作用，即熱療對食管癌細胞有輻射增敏作用。見圖3、表2。

圖3 不同處理組ECA109細胞流式結果

組別n細胞凋亡率(%)空白對照組314.9±0.8單純熱療組380.8±1.3ab單純放療組390.3±1.1ab熱療+放療組395.2±1.5a

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與熱療+放療組比較，bP<0.05。

3 討 論

細胞凋亡是一種復雜的生理和病理過程，它在細胞生長、發育過程中對細胞凋亡的發生具有重要的生物學意義，為維持機體內環境所必需的過程。近年來，隨著腫瘤分子生物學的快速發展，人們逐漸認識到腫瘤的發生、發展不僅是細胞增殖失控的結果，也可能是由細胞凋亡受限所致。

caspase-3屬于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的成員，細胞凋亡開始時，actived-caspase-3剪切聚ADP-核糖聚合酶(PARP酶)使之成為85×103和31×103的2段多肽，進而使PARP酶中與DNA相結合的兩個鋅指模體結構與羧基端的催化區域分離，失去其正常功能，Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶活性增高進而裂解核小體間的DNA，使細胞發生凋亡。而Bcl-2及其家族成員在細胞凋亡中起著雙重調節作用，Bcl-2與Bax決定細胞接受凋亡信號后存活與否，對腫瘤細胞凋亡的發生有重要意義；研究表明，Bcl-2表達下調和Bax表達上調能抑制腫瘤的生成，促進腫瘤細胞凋亡[6]。

熱療是近20年再度興盛起來的腫瘤治療方式，其對局部腫瘤的治療效果是其他手段無法比擬的。大量研究結果顯示，無論是體內還是體外培養的癌細胞，在42～43 ℃的高溫均可被殺死，而較長時間置于同樣條件下的正常細胞并沒有明顯損害[7]。此外，有研究報道，熱療聯合放療可使治療效果提高，兩者聯合既可以增強對腫瘤的殺傷作用，又可以降低射線劑量，從而實現協同增效作用[8]。

目前臨床上常采用43 ℃作為熱療溫度，且有報道顯示43 ℃可明顯促進人食管癌ECA109細胞的凋亡[9]，因此本研究選擇43 ℃作為實驗條件。研究結果發現，熱療聯合放療可以明顯提高caspase-3和Bax的表達，降低Bcl-2的表達。這提示熱療聯合放療能夠促進ECA109細胞凋亡，且克隆形成實驗提示其具有射線劑量依賴性。由此可見，熱療促進ECA109細胞的凋亡可能是其增敏機制之一。

綜上所述，熱療能夠提高人食管癌細胞的放射敏感性，這可能與熱療可以提高凋亡促進蛋白caspase-3和Bax的表達，降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，增加食管癌細胞的凋亡率密切相關。

[1]中華人民共和國衛生部．全國第三次死因回顧抽樣調查報告[M]．北京：中國協和醫科大學出版社，2008：10．

[2]詹宏杰，梁寒．腫瘤熱療的研究[J]．國外醫學：腫瘤學分冊，2005，32(1)：35-38．

[3]Waxman DJ，Schwartz PS．Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy[J]．Cancer Res，2003，63(24)：8563-8572．

[4]Chang HY，Yang X．Proteases for cell suicide:functions and regulation of caspases[J]．Microbiol Mol Biol Rev，2000，64(4)：821-846．

[5]Cory S，Adams JM．Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch[J]．Cancer Cell 2005，8(1)：5-6．

[6]Inoue S，Salah-Eldin AE，Omoteyama K．Apoptosis and anticancer drug resistance[J]．Hum Cell，2001，14(3)：211-221．

[7]Kim CS，Hill RP，Kumaradas JC，et al．Effect of simultaneous pulsed hyperthermia and pulsed radiation treatment on survival of SiHa cells[J]．Int J Hyperthermia，1998，14(6)：573-581．

[8]劉本春，張元芳．腫瘤熱療研究進展[J]．國外醫學：腫瘤學分冊，2004，31(10)：758-760．

[9]王希方，秦思達，杜寧，等．熱療通過提高活性caspase-3的表達促進食管癌EC109細胞凋亡[J]．現代腫瘤醫學，2012，20(11)：2236-2239．

Effect of themotherapy and themotherapy combined with radiotherapy on apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109

LIUGui-rong，KANGYa-hui，MAJian-xin，LIXue-mei△

(DepartmentofRadiotherapy,LianyungangMunicipalSecondPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222000,China)

Objective To research the effect of themotherapy and themotherapy plus radiotherapy on apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109.Methods Human esophageal cancer cells ECA109 were divided into four groups:normal control group,themotherapy group,radiotherapy group and themotherapy plus radiotherapy group.The apoptosis of human esophageal cancer cell ECA109 were induced by the themotherapy combined with different radiation doses.The flow cytometry Annexin V-FITC/PI double staining was adopted to detect the apoptosis rate,intracellular caspase-3,Bax,Bcl-2 expression were detected by Western blot and the radiosensitizing effect of themotherapy was observed by the clone colony formation assay.Results By adopting the clicking multiple target model for fitting the cellular survival curves,the survival fraction of human esophageal cancer cells ECA109 cells in the themotherapy plus radiotherapy group was significantly lower than that in the simple radiotherapy group(P<0.01),the themotherapy plus radiotherapy could increase the cellular radiation sensitivity,the sensitization enhancement ratio was 1.24;compared with the simple radiotherapy group,the apoptosis rate of ECA109 cells in the themotherapy plus radiotherapy group was significantly increased(P<0.05).Compared with the simple radiotherapy and simple themotherapy,the themotherapy plus radiotherapy acting on human esophageal cancer ECA109 cells could significantly increased the expression of apoptosis related proteins caspase-3 and Bax,and significantly decreased the Bcl-2 expression.Conclusion Themotherapy can increase the radiosensitivity of human esophageal cancer cells,its mechanism may be closely related with themotherapy increasing the apoptosis rate of human esophageal cancer cells.

thermotherapy； radiotherapy； esophageal cancer； radiosensitivity

劉桂榮，女，本科，副主任醫師，主要從事腫瘤放射治療及腫瘤熱療研究。△

，E-mail：lygcjc2009@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.026

A

1672-9455(2015)05-0646-03

2014-11-20

2014-12-28)