興奮性氨基酸對海馬神經干細胞的損傷作用的實驗研究①

劉 欣，胡國林，張 宇，齊志國

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

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興奮性氨基酸對海馬神經干細胞的損傷作用的實驗研究①

劉 欣，胡國林，張 宇，齊志國

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過不同濃度谷氨酸對海馬神經干細胞的致傷作用及其相關機制的研究，目的在于揭示興奮氨基酸對神經發生的作用，為多種神經缺失性病變的修復提供可靠的實驗依據。方法：取孕16d胎鼠神經干細胞培養，分為正常對照組、Glu高濃度組和Glu低濃度組。臺盼藍檢測細胞死亡率，全細胞膜片鉗記錄。結果：100μmol/LGlu干預24h后有30%神經干細胞死亡，300μmol/LGlu干預24h后有70%的神經干細胞死亡。300μmol/LGlu干預24h后可誘導(1000.25±104.67)pA內向電流與正常對照組和100μmol/LGlu干預24h后相比有顯著差異(P<0.01)。結論：隨著谷氨酸濃度的增加，神經干細胞死亡率增加，同時細胞內向電流增大，可能是其死亡率增加的原因之一。

谷氨酸；胱氨酸；神經干細胞。

谷氨酸(glutamicacid，Glu)為中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質，是腦組織中含量最高的一種氨基酸，參與多種生理功能的調控。正常情況下，Glu大部分存在于神經末梢內的Glu囊泡中，未梢去極化興奮時，通過Ca2+依賴方式釋放。但過量的Glu對神經有損傷作用。許多病理情況如癲癇、缺血、神經退行性疾病(帕金森病、肌萎縮側索硬化癥和阿爾茲海默癥) 等都與谷氨酸興奮毒性介導的神經細胞死亡密切相關[1]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

孕16d胚胎鼠由佳木斯大學動物實驗中心提供，分為正常對照組、高濃度谷氨酸組和低濃度谷氨酸組各10只。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經干細胞的培養：無菌操作取出海馬組織，置于裝有D-Hank's液的培養皿內返復沖洗，剪切為1mm3左右的組織塊，用巴氏吸管反復吹打，制成單細胞懸液，1000rpm×5min離心，用神經干細胞基礎培養液，并加入b-FGF吹打，分散制成單細胞懸液，經400目篩網過濾，去除細胞團塊，取濾液，進行細胞記數，以3×104個/mL接種于25cm2培養瓶中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，每3～5d換半液，每天觀察細胞生長情況。培養7～9d后進行試驗[2]。

1.2.2 海馬神經干細胞死亡率檢測:稱取臺盼藍4g，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100mL，濾紙過濾，PBS稀釋至0.4%。胰酶消化貼壁的神經干細胞，制備單細胞懸液。細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻，在3min內分別計數活細胞(未藍染細胞)和死細胞( 藍染細胞)。死亡率=藍染細胞/( 藍染細胞+未藍染細胞)×100%，實驗重復3次。

1.2.3 全細胞膜片鉗記錄：打開膜片鉗放大器和數模轉換器，將盛有貼壁細胞的培養皿倒置，通過顯微鏡和CCD圖像傳感器可視下挑選狀態較好、突觸完整邊界折光度好的神經干細胞；在3-5MΩ電極電阻下高阻抗封接，形成全細胞記錄模式，應用膜片鉗放大器記錄電流，2kHz濾波，采樣頻率為5kHz，PCLAMP-10軟件進行數據記錄和分析[3]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩種濃度的Glu對海馬神經干細胞的影響的光學顯微鏡下的變化。正常傳三代培養液中的海馬干細胞在培養液中呈懸浮生長，細胞聚集成球，細胞呈圓形，細胞核大且有立體感，折光性強。在100μmol/LGlu干預24h后有一定數量細胞從細胞球中脫落，沉于培養瓶底，細胞無折光性，色暗，胞體變小，細胞內細胞無法辨認，有少許此種表現細胞附于細胞球外，使細胞球變形或是折光性差。而在 300μmol/LGlu干預24h后，此種表現更加明顯。行臺盼藍計數細胞可見100μmol/LGlu干預24h后有30%神經干細胞死亡，300μmol/LGlu干預24h后有70%的神經干細胞死亡(P<0.01)。

2.2 兩種濃度的Glu對海馬神經干細胞膜電流的影響。在膜電位為- 70mV下記錄到全細胞電流，100μmol/LGlu干預24h后可誘導(300.67±14.55)

pA內向電流與正常對照組(66.01±4.12)pA相比有顯著差異(P<0.01)。300μmol/LGlu干預24h后可誘導(1000.25±104.67)pA內向電流與正常對照組和100μmol/LGlu干預24h后相比有顯著差異(P<0.01)。

表1 不同濃度谷氨酸對海馬神經干細胞致死率和內向電流的測定

a與正常對照組相比，P<0.01；b與100μmol/LGlu干預組相比，P<0.01。

3 討論

興奮性氨基酸作為神經遞質其興奮性毒性在神經細胞中的作用已經受到了極大的關注。其經受體作用持續活化神經細胞致神經細胞發生死亡或凋亡[4]。在興奮性氨基酸中谷氨酸作為人體神經系統中含量最高、分布最廣、作用最強的興奮性神經遞質，在人的胚胎初期，通過不均衡營養作用，造成基底神經節和邊緣系統神經元數目的不適當增加。在一般情況下谷氨酸多數存在于神經突觸的囊泡內，當神經末梢電位發生去極化時，囊泡與突觸前膜結合，將其釋放到突觸間隙，與后膜特異受體結合，完成興奮性突觸傳遞，發揮其生理作用。研究表明[5]，當過量產生谷氨酸時，其在神經系統中表現的具有神經毒性的作用，即所謂的興奮性毒性作用。當過量的谷氨酸與受體結合后，引起細胞Ca2+大量內流，使細胞內Ca2+超負荷，引起Ca2+穩態失調，從而激活依賴于鈣的酶系統引起一系列的細胞損傷。這是認為較為經典的致傷途徑。隨著研究的進一步深入其神經毒性作用是多途徑的，可通過抑制細胞膜上谷氨酸/胱氨酸轉運體的功能產生細胞毒性作用[6]，該作用以細胞內谷胱甘肽耗竭和活性氧成分升高為主要特征，被稱為谷氨酸的氧化毒性，對許多神經系統疾病的治療具有重要意義。本研究就針對不同濃度的谷氨酸對海馬區的神經干細胞的致傷作用的研究來明確其對神經發生有作用。隨著谷氨酸濃度的增加，其引起神經干細胞死亡的能力增強。本實驗通過光學顯微鏡觀察到，300μmol/LGlu干預24h后細胞死亡率明顯增加，細胞形態變化明顯。Tan等[7]采用海馬細胞系HT-22細胞，發現在BSO的作用下細胞內活性氧成分緩慢上升，而用谷氨酸后細胞內活性氧成分的升高24h后大部分的細胞死亡的研究結果相似。為了進一步明確其損傷機制，本研究應用膜片鉗技術，行全細胞電壓鉗檢測，對不同濃度的Glu干預24h后全細胞電流。實驗結果表明，高濃度的谷氨酸更能引起更大的細胞內向電流。其內向電流是否為其致傷的主要因素，還需進一步研究。但內向電流的增大是比較明確的，內向電流是由什么離子跨膜運動形成的，有實驗研究觀察到，在正常膜電位時，除去細胞內K+或增加細胞外K+的濃度都能抑制神經膠質細胞對谷氨酸的攝取功能[8]。如使膜去極化，膜電位從-80mV降至-18mV，谷氨酸的攝取也顯著下降。細胞內的K+可以用銫離子或銣離子來代替，而細胞外Na+的功能卻相對特異，似乎沒有其他離子能替代。鈣離子的作用在其中還有待于進一研究。

[1]李曉娟，郭直岳，王亞莉，等.ATP受體通道激活增加谷氨酸對海馬神經元的損傷[J]. 中風與神經疾病雜志，2013，10(30)：871-873

[2]VishwakarmaSK,BardiaA,TiwariSK,etal.Currentconceptinneuralregenerationresearch:NSCsisolation,characterizationandtransplantationinvariousneurodegenerativediseasesandstroke:Areview[J].JAdvRes，2014，5(3):277-294

[3]王顯鋼，湯華明，關政，等.膜片鉗新進展及在體膜片鉗技術[J].黑龍江醫藥科學，2005,28(2)：91-92

[4]TanJG1,LeeYY,WangT,etal.Heatshockprotein27overexpressioninCHOcellsmodulatesapoptosispathwaysanddelaysactivationofcaspasestoimproverecombinantmonoclonalantibodytitreinfed-batchbioreactors[J].BiotechnolJ,2014, 3:216-222

[5]LiN1,LiuB,DluzenDE,etal.ProtectiveeffectsofginsenosideRg2againstglutamate-inducedneurotoxicityinPC12cells[J].JEthnopharmacol，2007,111(3):458-463

[6]FregaM1,PasqualeV,TedescoM,etal.Corticalculturescoupledtomicro-electrodearrays:anovelapproachtoperforminvitroexcitotoxicitytesting[J].NeurotoxicolTeratol，2012, 34(1):116-127

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[8]MarcaggiP1,HirjiN,AttwellD,etal.ReleaseofL-aspartatebyreversalofglutamatetransporters[J].Neuropharmacology，2005, 49(6):843-849

2014年佳木斯大學研究生科技創新項目,編號：LZR2014_17。

劉欣(1988～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

齊志國(1972～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：drqizhiguo@163.com。

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文章編號：1008-0104(2015)03-0050-02

2015-03-09)