應用iTRAQ對唐氏綜合征胎兒臍帶血的蛋白質組學研究*

文錦麗，林秀華，郭 輝，李武縣，林琳華，戴 勇△

(暨南大學第二臨床學院/深圳市人民醫院：1.臨床醫學研究中心；2.產前診斷中心，廣東深圳 518020)

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·論 著·

應用iTRAQ對唐氏綜合征胎兒臍帶血的蛋白質組學研究*

文錦麗1，林秀華1，郭 輝1，李武縣1，林琳華2，戴 勇1△

(暨南大學第二臨床學院/深圳市人民醫院：1.臨床醫學研究中心；2.產前診斷中心，廣東深圳 518020)

目的 篩選并鑒定唐氏綜合征胎兒與健康對照者差異性表達蛋白質，以尋找唐氏綜合征胎兒的生物標記物。方法 應用同位素標記相對和絕對蛋白定量法和功能聚類分析法篩查和分析唐氏綜合征胎兒臍帶血和正常胎兒臍帶血的差異表達蛋白。結果 共篩選鑒定到506種差異表達蛋白，其中最顯著的3種蛋白分別是基質蛋白-3、胸腺肽β10和骨橋蛋白。結論 唐氏綜合征胎兒和正常胎兒臍帶血血清蛋白存在較多差異表達蛋白，其中基質蛋白-3、胸腺肽β10和骨橋蛋白等顯著差異蛋白可能作為潛在的臨床篩查生物標志物。

唐氏綜合征；蛋白質組學；同位素標記相對和絕對蛋白定量法；功能聚類分析法

21-三體綜合征又稱唐氏綜合征(DS)，是最常見的染色體病，在1/600～1/800的活產兒，或1/150次妊娠中有一次發生概率[1]。DS以智力障礙和多發畸形為主要特征，迄今尚無有效的治療方法，因此對胎兒進行早期宮內診斷和有效干預對降低DS患兒出生率顯得尤為重要。目前血液生化唐氏篩查檢出率為60%～75%，并且假陽性率約5%[2]。迫切需要尋找一種更安全、有效的篩查方法，同位素標記相對和絕對蛋白定量法(iTRAQ)是Applied Biosystems公司近年發展的蛋白質分析技術，該技術的應用使快速篩選及鑒定潛在生物標記蛋白成為可能。本研究應用八通道的iTRAQ結合多維光譜和功能聚類(GO)分析法篩選和鑒定DS胎兒的差異蛋白質，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 DS胎兒組和正常胎兒組各10例。所有受試者均知情同意并簽署知情同意書，實驗符合人體試驗倫理學標準，并經過獲得醫院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質提取和濃度測定 每組稱取適量的樣品，加入適量蛋白裂解液溶解，然后分別添加終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)和2 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)，5 min后添加終濃度為10 mmol/L的二硫蘇糖醇；超聲15 min后25 000×g離心20 min，取上清液。上清液加入5倍體積預冷丙酮，在-20 ℃沉淀2 h，然后16 000×g離心20 min，棄上清液。取適量沉淀，加入適量蛋白裂解液溶解，然后分別添加終濃度為1 mmol/L的PMSF和2 mmol/L的EDTA，5 min后添加終濃度為10 mmol/L的DTT，超聲15 min后25 000×g離心20 min，取上清液。上清液在56 ℃條件下加入終濃度為10 mmol/L的DTT處理1 h，還原打開二硫鍵。再加入終濃度為55 mmol/L碘代乙酰胺暗室靜置45 min，進行半胱氨酸的烷基化封閉。加入適量冷丙酮，在-20 ℃靜置2 h后以25 000×g離心20 min，棄上清液；沉淀在200 μL 0.5 mol/L TEAB中超聲溶解15 min并再次離心20 min后取上清液用于定量。按照Bradford法測定蛋白質濃度。

1.2.2 SDS電泳 配置12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，每組樣品分別與4×loading buffer 混合，95 ℃加熱5 min。每組樣品上樣量為30 μg，標記上樣量10 μg。120 V恒壓電泳2 h。電泳結束后，用染液染色2 h，再用脫色液脫色3～5次，每次30 min。

1.2.3 蛋白質酶解和iTRAQ標記 每組樣品精確取出40 μg蛋白，按照蛋白∶酶=20∶1的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h，按上述比例再補加胰蛋白酶1次，37 ℃繼續酶解8 h。胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段，再用0.5 mol/LTEAB復溶肽段，按照手冊進行iTRAQ標記，兩組肽段被不同的iTRAQ標簽標記(健康對照組-iTRAQ114，DS組-iTRAQ 116)后，在室溫條件下靜置2 h。

1.2.4 SCX分離和基于QE的液質聯用分析 將標記后的兩組肽段混合，采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4.6×250 mmol/L型號的Ultremex SCX柱對樣品進行液相分離。進入液相分離的肽段進入到串聯ESI質譜儀(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA)。一級質譜分辨率設置為70 000，二級質譜分辨率為17 500；掃描的質荷比范圍為一級350～2 000，二級100～1 800。

1.2.5 Western-blot驗證差異蛋白 根據查閱文獻本文選擇較多的差異蛋白質和較少的差異蛋白質進行Western-blot驗證。驗證步驟分成5步，分別是提取蛋白質、二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質轉移、免疫印跡、數據收集。

1.3 統計學處理 平均報告離子比率大于15的蛋白多肽歸類為上調，平均報告離子比率小于0.07歸類為下調。然后用在線GO工具在線鑒定蛋白的功能。

2 結 果

以多肽大于1和95%可信區間作為閾值，有506種蛋白表達上調或者下調，其中顯著差異的蛋白有24種。表1代表DS胎兒跟正常胎兒比較表達上調(n=16)和下調(n=8)的蛋白，其中3種蛋白(基質蛋白-3、胸腺肽β10、骨橋蛋白)在DS胎兒中顯著高表達。

在鑒定分離出的蛋白中，對具有注釋名的1 375種蛋白用GO進行分子功能、細胞組分和生物功能歸類分析。532種參與分子功能，其中326種參與蛋白結合，23種參與輔助因子結合，32種參與脂質結合，7種參與氧結合，12種參與模式結合，5種參與細胞外基質結合，5種參與細胞表面結合，20種參與糖類結合，10種參與核酸結合，9種參與維生素結合，83種參與核苷酸結合。從細胞組分歸類中有318種膜蛋白定位于細胞內細胞器，278種定位于膜綁定細胞器。在大分子復合物中，有41種核糖核蛋白復合體和7種蛋白-DNA復合體。在生物過程歸類中有244種蛋白參與主要代謝過程，230種蛋白參與細胞代謝過程。有123種蛋白參與轉運同時有124種蛋白參與建立細胞定位。

表1 DS胎兒跟正常胎兒臍帶血清蛋白質組學比較

續表1 DS胎兒跟正常胎兒臍帶血清蛋白質組學比較

3 討 論

iTRAQ有利于篩選生物標志物，通過檢測iTRAQ標記多肽釋放的報告離子峰值強度并比較蛋白質豐度，篩選并鑒定有價值的DS胎兒生物標志蛋白，本研究應用iTRAQ和GO分析法尋找DS胎兒臍帶血蛋白質標志物。結果鑒定出506種蛋白，通過GO分析，鑒定到了幾個可能有臨床意義的差異蛋白。

表1列出了DS胎兒上調和下調的蛋白，其中對基質蛋白3、胸腺肽β10和骨橋蛋白的研究較多。基質蛋白-3是相對分子質量為125×103的內核基質蛋白，在進化中高度保守。基質蛋白-3包含一個雙重核定位信號，2個鋅指結構域和2個標準的RNA識別模指[3-4]。基質蛋白-3由MATR3編碼，在骨骼肌有表達，常染色體和有活性的X染色體區域均有MATR3，基質蛋白-3是一個新的人核心基質蛋白靶標，其降解能誘導細胞從凋亡向壞死轉換[5]。胸腺肽β10由43種氨基酸組成，編碼基因定位于2號染色體p11.2。有研究顯示胸腺肽β10可通過干擾Ras功能而抑制血管生成[6]。在許多腫瘤中，例如胰腺、結腸、乳腺、甲狀腺和胃腫瘤中均發現有胸腺肽β10升高[7]。因而有學者認為,胸腺肽β10也許可以作為一個腫瘤診斷和預后的有用生物標記物[8]。Kim等[9]發現胸腺肽β10通過干擾肌動蛋白和抑制Ras從而抑制腫瘤生長和血管生成。骨橋蛋白在DS胎兒肝細胞和巨噬細胞樣細胞中表達，這些DS胎兒在圍生期即可出現肝纖維化。有學者提出骨橋蛋白也許還與其他細胞因子，如TGF-β1、PDGF等相關聯，共同參與了DS新生兒常見的肝竇周圍纖維化的發病機制[10]。

本研究僅僅初步篩選出潛在的生物標志物，還必須進一步研究確認和檢測其敏感性和特異性等深入研究。

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[3]SuiW,TangD,ZouG,etal.Differentialproteomic analysis of renal tissue in lupus nephritis using iTRAQ reagent technology[J].Rheumatol Int,2012,32(11):3537-3543.

[4]Hisada-Ishii S,Ebihara M,Kobayashi N,et al.Bipartite nuclear localization signal of matrin 3 is essential for vertebrate cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,354(1):72-76.

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[9]Kim YC,Kim BG,Lee JH.Thymosin β10 expression driven by the human TERT promoter induces ovarian cancer-specific apoptosis through ROS production[J].PLoS One,2012,7(5):e35399.

[10]Tokairin T,Nishikawa Y,Watanabe H,et al.Osteopontin expression in the liver with severe perisinusoidal fibrosis:Autopsy case of Down syndrome with transient myeloproliferative disorder[J].Pathol Int,2008,58(1):64-68.

Proteomics study of cord blood in Down′s syndrome fetuses by iTRAQ*

WENJin-li1,LINXiu-hua1,GUOHui1,LIWu-xian1,LINLin-hua2,DAIYong1△

(1.ClinicalMedicinalResearchCenter;2.DepartmentofAntenatalDiagnosis,ShenzhenPeople′sHospital,theSecondClinicalMedicineCollegeofJinanUniversity,Shenzhen,Guangdong518020,China)

Objective To identify the differentially expressed proteins between fetuses with Down′s syndrome and healthy control,so as to screen the potential biomarkers of fetuses with Down′s syndrome.Methods To investigate the differentially expressed proteins in cord blood of fetus with Down′s syndrome and normal fetus using isobaric tagging for relative and absolute protein quantification and gene gene ontology analysis.Results A total of 506 differentiate proteins were identified,in which 3 proteins (Matrin-3，Thymosin beta 10 and Osteopontin) were significant.Conclusion The proteomics of the serum are significant different among normal fetus and fetus with Down′s syndrome.Some of the protein,such as Matrin-3，Thymosin beta 10 and Osteopontin,may have potential applying value in clinic screening pratice.

Down′s syndrome;proteomics;iTRAQ;GO analysis

廣東省深圳市科技計劃資助項目(201202121)；廣東省深圳市科創委重點資助項目(CXZZ20130321090846345)。

文錦麗，女，本科，副主任技師，主要從事臨床醫學免疫檢驗及科研工作。△

，E-mail：daiyong22@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.005

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1672-9455(2015)23-3461-02

2015-04-01

2015-06-21)