熒光原位雜交技術在先天性心臟病產前診斷中的應用

趙 婧,黃 湘,李紅艷,梁少霞

(廣東省中山市博愛醫院產前診斷中心 528400)

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·論 著·

熒光原位雜交技術在先天性心臟病產前診斷中的應用

趙 婧,黃 湘,李紅艷,梁少霞

(廣東省中山市博愛醫院產前診斷中心 528400)

目的 探討采用熒光原位雜交技術(FISH)檢查法對先天性心臟病胎兒進行染色體22q11微缺失產前診斷的臨床應用。方法 應用常規染色體核型分析及FISH檢查法，對2012年3月至2014年10月中山市博愛醫院收治的52例疑似妊娠22q11微缺失胎兒的孕婦進行產前22q11微缺失檢查并跟蹤隨訪。結果 所有胎兒染色體核型分析均無異常，FISH檢查結果顯示3例呈陽性。結論 染色體核型分析無法檢測22q11微缺失綜合征，因此對有22q11微缺失先天性心臟病風險的胎兒產前診斷應用FISH檢查法，可提高檢測的準確性。

22q11微缺失;熒光原位雜交技術;先天性心臟病;產前診斷

先天性心臟病(CHD)是一種嚴重影響人類健康的疾病，其病因復雜，治療困難。我國每年大約有(10～15)萬CHD患兒出生，患兒家庭和社會都承擔著巨大的負擔。CHD主要是指胎兒在胚胎發育期心臟及周圍血管組織發育異常造成的胎兒出生后心臟、血管功能結構的異常，是最常見的一種胎兒畸形，也是我國生育監測的主要病種之一[1]。新生兒CHD患病率為0.8%～1.0%，因為CHD治療困難、新生兒手術的復雜和危險，使CHD病死率極高。有統計顯示，死胎死產中有1/5是患有嚴重CHD的胎兒，而因先天性缺陷夭折的新生兒中嚴重CHD患兒占1/3，兒童期死亡患兒超過半數是CHD患兒[2]。作為一種先天畸形疾病，CHD的發病原因復雜，目前研究主要與遺傳、環境、遺傳-環境因素共同作用有關[3]。遺傳因素主要體現為染色體異常，而22q11微缺失綜合征是最常見的一種染色體異常，是比較常見的CHD病因。研究報道最多的心臟畸形，國內比例為74%，美國該比例達85%，一般是圓錐動脈干呈現畸形，表現為法洛四聯征、主動脈中斷、肺動脈閉鎖、室間隔缺損等，前二者疾病的預后極差[4]。對于22q11微缺失的檢查，由于該缺失片段大小在1.5～3.0 Mb，是比進行染色體核型分析時的分辨下限5.0 Mb還小的片段，因此通過常規的染色體核型分析產前診斷法無法檢測出該疾病，需要引入分辨率更高的技術手段。本研究采用熒光原位雜交技術(FISH)檢查法對22q11微缺失CHD胎兒進行產前診斷，FISH檢查法是將經熒光標記的特異性探針與相關染色體中DNA序列雜交，再通過熒光顯微鏡觀察待檢染色體是否存在某些片段的缺失[5]。該方法快速、準確、敏感性高、特異性強，是進行22q11微缺失檢查的首選技術。本研究即對使用FISH檢查法的22q11微缺失CHD胎兒的產前檢查的臨床應用進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3月至2014年10月本院收治的52例似妊娠22q11微缺失胎兒的孕期婦女作為研究對象，所有產婦的胎兒胎齡3～8個月不等，孕婦年齡23～35歲，平均28.4歲。研究對象包括24例曾生產或引產過一個CHD或面部畸形胎兒的孕婦，本次妊娠的彩色多普勒超聲檢測中未顯示心臟畸形或面部畸形；23例產前彩色多普勒超聲檢測顯示胎兒有心臟畸形[6]；5例超聲檢測懷疑胎兒有唇、腭裂。進一步研究前，所有病例及其家屬均知曉研究內容，簽署知情同意書，此研究獲得了醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 進行羊水細胞的常規染色體核型分析及FISH檢查[7]。

1.2.1 羊水細胞獲得 施行羊膜腔穿刺術以獲得適量羊水細胞，用于實驗室的染色體核型分析及FISH檢查。采集羊水細胞前，產婦排凈膀胱、仰臥位；事前經超聲檢查確定胎盤位置、羊水深度，便于穿刺部位的選擇；穿刺時一手固定穿刺部位，一手準確將穿刺針垂直刺入宮腔，拔除針芯，見有清亮的淡黃色羊水溢出，使用注射器抽取10 mL羊水后再插入針芯、拔除穿刺針。將羊水存入無菌試管，送實驗室培養以進行下一步檢查；對產婦穿刺部位進行無菌敷料處理，觀察半小時如無異常，告知相關注意事項后即可離開。

1.2.2 常規染色體核型分析 22q11微缺失綜合征除了微片段缺失外，可能還伴有染色體異位，數目、形態異常(環形)等畸變。因此在進行FISH檢查前常需通過常規染色體核型分析以排除可能的畸變。將所采集的羊水裝于離心管中進行細胞接種培養；獲得的細胞經固定、滴片、烤片制成標本，將染色體標本片放入所制備的胰蛋白酶溶液中，振搖2、3 min用生理鹽水漂洗，經染色劑染色、沖洗、曬干后進行鏡檢，查看染色體帶紋顯現(顯帶)效果，可多做幾次取得最滿意效果；選擇鏡檢中分散效果較好的核型為圖像采集對象。

1.2.3 FISH檢查 將染色體核型分析余下的細胞懸液制成標本片備用。以北京金菩嘉公司的雙色熒光22q11探針和相應試劑盒為檢測工具，探針與變性后標本片的雜交結合位點為TUPLE1：22q11；ARSA：22q13。二者的熒光信號分別為紅色和綠色，是彼此的內對照探針，而TUPLE1與ARSA互為內對照基因。以熒光顯微鏡記錄最終結果，通過FISH圖像分析處理系統采集染色體核型與熒光信號。

1.3 判定標準 FISH檢查后進行鏡檢，隨機選擇100個左右中期分裂狀態的細胞進行觀察，細胞內有綠色熒光標記的是22號染色體，若22號染色體上還可見2個紅色熒光信號，說明22q11無缺失；若只見一個紅色熒光信號，說明存在22q11微缺失。因此，判定結果為：若90%以上細胞內各有2個紅、綠熒光信號(圖1)，可判定為FISH檢查呈陰性，胎兒不存在22q11缺失；若有60%分裂狀態細胞出現1個紅色熒光信號、2個綠色熒光信號(圖2)，可判定FISH檢查呈陽性，胎兒存在22q11微缺失。

圖1 FISH檢查陰性結果

圖2 FISH檢查陽性結果

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件對所得數據進行描述性統計學分析。

2 結 果

2.1 常規染色體核型分析結果 對所有產婦的羊水細胞進行常規染色體核型分析后顯示未檢測到染色體微缺失、核型分析均無異常，可排除可能存在的染色體異位、數目異常等染色體畸變。

2.2 FISH檢查結果 24例曾生產或引產過一個CHD或面部畸形胎兒的孕婦，本次妊娠的彩色多普勒超聲檢測中未顯示異常；FISH檢查結果顯示超過90%細胞內有2個紅2個綠熒光信號，說明不存在22q11微缺失。23例產前彩色多普勒超聲檢測顯示胎兒有心臟畸形的孕婦，施行FISH檢查的產前診斷，結果顯示，20例患者有90%細胞內呈現2個紅2個綠熒光信號，說明不存在22q11微缺失，另3例有60%以上細胞呈現1紅2個綠熒光信號，說明存在22q11微缺失；5例超聲檢測懷疑胎兒有唇、腭裂的病例產前診斷FISH檢測結果顯示有2個紅2個綠熒光信號，不存在22q11微缺失。得出FISH檢查結果后，對于證實有22q11微缺失的陽性患者，孕婦及其家屬同意進行引產手術，而其他患者出于個人考慮作出了活產與引產的決定，詳細檢查和隨訪結果見表1。

表1 52例孕婦產前FISH檢查及隨訪結果表(n)

3 討 論

CHD是導致新生兒缺陷或死亡的主要原因，病因復雜。目前少數確證的病因之一認為它是一種多基因遺傳病，是22q11微缺失綜合征的主要表型[8-9]。CHD治療困難，目前只能通過手術治療，但花費巨大，為患兒帶來身體的痛苦，更可能造成家庭嚴重的經濟負擔。因此，通過產前診斷篩選，確定胎兒是否患有CHD，根據產前診斷結果對胎兒的預后進行更準確、合理評估十分重要。但以往檢查方法中，若超聲檢查顯示胎兒心臟有畸形或其他畸變，通常只進行常規的染色體核型分析，分析無異常便判定胎兒未患CHD。胎兒出生后，進一步檢查發現患有22q11微缺失綜合征，該疾病會造成人體多個系統、器官的缺陷，包括CHD、唇裂和腭裂、心胸發育不良、認知障礙、免疫力低下等[10]。這顯示了染色體核型分析法在CHD產前診斷上精確性不足的問題，因此目前普遍引進并采用分辨率、準確性更高，敏感度、特異性更強的FISH檢查法進行CHD產前診斷[11]。

22q11微缺失是指22號染色體長臂1區1帶2亞帶內22q11.21～22q11.23這一固定區域的雜合性缺失，與CHD密切相關。22q11微缺失綜合征的新生兒患病率在1/6 000～1/4 000且不同性別患病率無顯著差異，該綜合征會導致多種生理缺陷，涉及多個重要臟器，包括心臟畸形、面部異常、唇裂和腭裂、胸腺發育不良等，且隨著疾病進展，患兒的認知學習能力、精神狀態、身體發育等都會出現異常或遲緩；臨床表型主要有CHD、圓錐動脈干-面部異常綜合征、腭-心-面綜合征(VCFS)及迪格奧爾格綜合征。現今仍沒有關于遺傳病的有效治療手段，從優生優育角度出發，防止患重大先天性疾病患兒的出生是主要手段，而準確、有效的產前診斷是降低患病患兒出生率的重要方法。

目前研究指出22q11微缺失主要是由于染色體在減數分裂后期進行重組時出現了不對稱等異常現象造成的，該微片段的缺失會造成新生兒多方面的身體缺陷，主要包括DiGeorge綜合征、錐干型心臟畸形、VCFS等，其他22q11缺失的表型還有低血鈣癥、免疫功能低下等。22q11微缺失片段在D22S427/1638到D22S306/308區間內，片段大小1.5～3.0 Mb，小于染色體核型分析的分辨率下限5 Mb，因此需要分辨率更高的技術手段才能進行檢測[12]。FISH檢查法通過特異性探針與羊水細胞雜交，檢測TUPLE1基因，可用于判定胎兒是否存在22q11微缺失，可為22q11微缺失CHD疑似胎兒的產前診斷提供更可靠的檢測依據，為遺產咨詢、優生優育提供參考，有利于下一步及時的臨床干預和風險評估。

本研究中的52例孕婦羊水細胞的染色體核型分析均顯示無異常，而FISH檢查有3例呈陽性，陽性病例中有2例是室間隔缺損的指征，說明22q11微缺失可能與胎兒心臟室間隔缺損有較大相關性，最終陽性病例均選擇了引產終止妊娠。另20例彩色多普勒超聲顯示胎兒有心臟畸形、22q11微缺失高風險的病例最終FISH檢測結果呈陰性，說明CHD是多基因遺傳與環境因素共同作用的結果，未來還需對CHD的病因進行更深入的分析以指導診斷與治療[13]。目前對于患有22q11微缺失綜合征新生兒的治療方法有手術治療心臟畸形，手術整形、矯正腭及面部異常，加強補鈣治療低血鈣癥，存在語言、認知、行動發育緩慢者，應及時進行早教干預加以控制，以期慢慢得到改善。

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Application of FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease

ZHAOJing,HUANGXiang,LIHong-yan,LIANGShao-xia

(PrenatalDiagnosisCenter,BoaiHospitalofZhongshanCity，Zhongshan，Guangdong528400,China)

Objective To investigate the detection of 22q11 micro-deletion by FISH in the prenatal diagnosis of congenital heart disease.Methods 52 pregnant women admitted to Boai Hospital of Zhongshan City during March 2012 to October 2014 who were suspected pregnancy 22q11 micro-deletion fetuses were received conventional chromosome karyotyping and FISH test for prenatal diagnosis about 22q11 micro-deletion,then were followed up.Results None of the karyotype analysis results showed abnormal,while there were 3 positive cases tested by FISH.Conclusion Karyotype analysis cannot detect 22q11 micro-deletion syndrome,hence FISH should be used in the prenatal diagnosis for fetuses with the risk of congenital heart disease caused by 22q11 micro-deletion,which can improve the accuracy of detection.

22q11 micro-deletion;FISH;congenital heart disease;prenatal diagnosis

趙婧，女，本科，主管檢驗師，主要從事細胞遺傳學臨床研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.025

A

1672-9455(2015)23-3512-03

2015-04-02

2015-06-29)