血培養陽性培養物直接藥敏試驗的評價*

答 嶸，王 偉，李 芳，袁 晶

(西安交通大學第一附屬醫院：1.檢驗科；2.神經外科 710061)

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·論 著·

血培養陽性培養物直接藥敏試驗的評價*

答 嶸1，王 偉2△，李 芳1，袁 晶1

(西安交通大學第一附屬醫院：1.檢驗科；2.神經外科 710061)

目的 通過比對血培養陽性培養物直接藥敏試驗與標準藥敏試驗結果的一致性，探討血培養直接藥敏報告在臨床血流感染診治中的應用價值。方法 選取西安交通大學第一附屬醫院2014年12月到2015年2月的血培養陽性標本，在進行標準藥敏試驗的同時，陽性報警后根據涂片染色結果按照革蘭陽性菌和革蘭陰性菌采用紙片擴散法進行直接藥敏試驗。統計直接藥敏與標準藥敏試驗結果的符合率、嚴重錯誤率、重大錯誤率、微小錯誤率。結果 該研究共包括血培養陽性菌株101株，藥敏試驗比對結果875個。革蘭陽性菌標準符合率為94.3%，嚴重錯誤率為0.8%，重大錯誤率為0.4%，微小錯誤率為4.5%；革蘭陰性菌標準符合率為94.1%，嚴重錯誤率為0.0%，重大錯誤率為3.7%，微小錯誤率為2.2%。革蘭陽性菌中利奈唑胺、四環素、替考拉寧、萬古霉素，革蘭陰性菌中亞胺培南與美羅培南符合率為100.0%。氟喹諾酮類在革蘭陽性菌與革蘭陰性菌中均出現微小錯誤。革蘭陽性菌中克林霉素出現嚴重錯誤。革蘭陰性菌中頭孢類抗菌藥物符合率偏低，并易出現重大錯誤。結論 利用血培養陽性物采用紙片擴散法進行直接藥敏試驗不僅能夠快速、準確地為臨床提供初步藥敏結果，更易于在臨床廣泛使用。

血培養； 直接藥敏試驗； 評價

全自動血培養系統在臨床微生物實驗室的廣泛應用，大大提高了血培養的敏感性和時效性。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)快速微生物鑒定平臺的建立為臨床早期經驗性抗感染治療提供了有力保障，血培養直接藥敏試驗報告將會提高臨床目標性抗感染治療的時效性。目前臨床微生物實驗室在血培養檢測中多能夠做到一級報告與三級報告，二級報告僅在臨床需要時進行而未常規開展。血培養二級報告雖然也可通過培養物預處理采用肉湯稀釋法進行報告，但是考慮降低成本與簡化操作，多采用紙片擴散法進行直接藥敏試驗，報告抗菌藥物的抑菌圈直徑[1-3]。20世紀70年代直接藥敏試驗(DAST)得到廣泛應用，當時標準藥敏試驗方法為紙片擴散法，而現在大多數大型綜合性醫院采用儀器進行微量肉湯稀釋法檢驗作為標準藥敏試驗。直接藥敏試驗結果與最終藥敏結果報告的一致性則是血培養二級報告的關鍵。本研究擬對血培養陽性標本采用紙片擴散法進行直接藥敏試驗，并與標準藥敏試驗結果進行比對，評價直接藥敏試驗的準確率，為常規開展血培養二級報告提供實驗室數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安交通大學第一附屬醫院2014年12月至2015年2月的血培養陽性標本共101例，其中革蘭陽性菌31例，革蘭陰性菌70例。

1.2 儀器與試劑 BacT/ALERT 3D全自動細菌/分枝桿菌培養檢測系統(生物梅里埃，法國)，VITEK 2全自動微生物分析系統(生物梅里埃，法國)，VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(生物梅里埃，法國)，VITEK MS全自動快速質譜微生物檢測系統(生物梅里埃，法國)，中和抗菌藥物需氧瓶、厭氧瓶與小兒瓶(生物梅里埃，法國)，血瓊脂平板(生物梅里埃，法國)，巧克力平板(生物梅里埃，法國)，MH瓊脂平板(生物梅里埃，法國)、藥敏紙片(OXOID，英國)、鑒定與藥敏卡(生物梅里埃，法國)。

1.3 方法

1.3.1 血培養 血培養陽性報警后，取出陽性瓶。無菌抽取瓶中培養液，接種至血平板和巧克力平板，置于CO2恒溫培養箱中35 ℃培養。同時進行涂片染色，進行血培養一級報告。

1.3.2 直接藥敏試驗 無菌抽取瓶中培養液0.1 mL均勻涂布于MH平板上，按照染色結果，革蘭陽性菌貼環丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、四環素、替考拉寧、萬古霉素紙片，革蘭陰性菌貼阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、環丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦紙片。置35 ℃孵育16～18 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.3 標準藥敏試驗 陽性瓶培養液于血平板和巧克力平板孵育24 h后，按照操作規程制備菌懸液，上機進行細菌生化及藥敏試驗，并將最終報告發放臨床，即三級報告。鏈球菌通過傳統紙片擴散法進行藥敏試驗。

1.3.4 質量控制 使用標準菌株進行質量控制，上機質控均按照儀器說明書進行，紙片擴散法藥敏質控按照臨床和實驗室標準化協會(CLSI)M100-S23文件進行。

1.4 標準符合率 運用CLSI解釋規則，直接藥敏和標準藥敏試驗方法的結果一致，如敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)，為符合。嚴重錯誤：直接藥敏為S而標準藥敏為R。重大錯誤：直接藥敏為R而標準藥敏為S。微小錯誤：直接藥敏為R或S而標準藥敏為I；直接藥敏為I而標準藥敏為R或S。

2 結 果

2.1 直接藥敏試驗中病原菌種類 本研究共包括革蘭陽性菌31株，革蘭陰性菌70株。革蘭陽性菌中，包括金黃色葡萄球菌8株、屎腸球菌8株、表皮葡萄球菌7株、人型葡萄球菌3株、化膿鏈球菌2株，以及鶉雞腸球菌、緩慢葡萄球菌、前庭鏈球菌各1株；革蘭陰性菌包括大腸埃希菌55株、肺炎克雷伯菌5株、鮑曼不動桿菌3株、產酸克雷伯菌3株、銅綠假單胞菌2株、弗氏檸檬酸桿菌1株及陰溝腸桿菌1株。

2.2 革蘭陽性菌藥敏試驗標準符合率 革蘭陽性菌環丙沙星、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、四環素、替考拉寧、萬古霉素標準符合率見表1。

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗標準符合率 革蘭陰性菌阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、環丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦標準符合率見表2。

表1 革蘭陽性菌藥敏試驗標準符合率[n(%)]

表2 革蘭陰性菌藥敏試驗標準符合率結果[n(%)]

3 討 論

血流感染的有效治療依賴于早期目標性抗感染治療，而目標性抗感染治療極大程度地依賴于及時、準確的微生物藥敏結果。隨著MALDI-TOF技術在臨床微生物領域的應用，微生物鑒定比傳統生化鑒定能夠提前24 h完成。Machen等[4]采用血培養陽性培養物經過過濾處理后直接利用質譜進行鑒定的同時進行藥敏試驗，能夠在血培養陽性報警后24 h內完成鑒定與藥敏的最終報告。但是質譜儀價格昂貴，目前僅有少數大型綜合性三甲醫院檢驗科臨床微生物室用于臨床標本鑒定。也有學者利用血培養陽性培養物處理后采用VITEK 2系統進行鑒定和藥敏[5]。但是利用全自動鑒定藥敏儀進行快速藥敏試驗標本前處理通常操作繁瑣，并會增加生物安全風險與檢測成本，絕大多數醫院并無條件開展。而血流感染治療重在早期正確使用抗菌藥物，所以血培養直接藥敏報告對于臨床血流感染的目標性抗感染治療具有重要指導價值。

血流感染時血培養大多為單一致病菌，因此適合于進行直接藥敏試驗。為了縮短血培養報告的時間，學者們反復強調從血培養陽性瓶取培養物直接進行藥敏試驗的重要性，血培養分級報告能夠縮短患者住院時間、降低罹患難辨梭菌相關腹瀉的風險、降低患者平均病死率與感染相關病死率[6-7]。本研究對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的直接藥敏試驗與VITEK 2儀器法的標準藥敏結果進行比對，革蘭陽性菌標準符合率為94.3%，嚴重錯誤率為0.8%，重大錯誤率為0.4%，微小錯誤率為4.5%；革蘭陰性菌標準符合率為94.1%，嚴重錯誤率為0.0%，重大錯誤率為3.7%，微小錯誤率為2.2%，本研究數據與文獻報道相似。血培養革蘭陰性菌進行直接藥敏試驗與標準藥敏結果比對，顯示紙片擴散法血培養標本直接藥敏試驗標準符合率96.2%[8-9]。陸文香等[10]通過對103份血培養陽性標本進行直接藥敏試驗，發現標準符合率92.6%，嚴重錯誤率0.2%，重大錯誤率3.1%，微小錯誤率4.1%。保勇等[11]研究發現血培養革蘭陰性菌直接藥敏試驗測定的標準符合率為85.0%，嚴重錯誤率為0.0%，重大錯誤率為6.3%，微小錯誤率為8.6%；血培養革蘭陽性菌直接藥敏試驗測定的標準符合率為84.4%，嚴重錯誤率為0.0%，重大錯誤率為7.0%，微小錯誤率為8.5%。Edelmann等[2]研究顯示革蘭陽性菌標準符合率為93.9%，嚴重錯誤率為1.6%，重大錯誤率為1.1%，微小錯誤率為2.6%。革蘭陰性菌標準符合率為91.9%，嚴重錯誤率為1.2%，重大錯誤率為0.7%，微小錯誤率為6.3%。血培養陽性培養物直接藥敏試驗在細菌中有一定研究與應用，但是在真菌血癥中研究較少，需進一步探索。研究表明直接真菌藥敏試驗可以采用Sensititre YeastOne(TREK Diagnostic Systems,Cleveland,Ohio)進行，40例中未出現非常重大錯誤和重大錯誤，僅有4例微小錯誤[12]。上述研究結果均顯示利用血培養陽性物進行直接藥敏試驗與標準藥敏試驗結果基本一致，能夠用于臨床血培養二級報告。

本研究發現直接藥敏試驗革蘭陽性菌中利奈唑胺、四環素、替考拉寧、萬古霉素均符合，革蘭陰性菌中僅亞胺培南與美羅培南均符合，而且這些抗菌藥物如果敏感，抑菌圈直徑就顯著大于折點，如果耐藥則基本無法觀測到抑菌圈。氟喹諾酮類藥物包括環丙沙星與左氧氟沙星在革蘭陽性菌與革蘭陰性菌中均出現微小錯誤，抑菌圈直徑總是介于折點范圍左右，造成判讀為中介，而標準藥敏多為敏感。革蘭陽性菌中需注意在直接藥敏試驗中進行D試驗，本研究中有2株革蘭陽性菌直接法克林霉素抑菌圈顯示為敏感，儀器法MIC值也提示敏感，但是專家系統給出判讀為耐藥，直接法進行D試驗，驗證確實存在誘導耐藥，這是非常需要重視的。革蘭陰性菌中頭孢類抗菌藥物包括頭孢吡肟與頭孢他啶符合率均在80%～90%，重大錯誤率均在10%以上，提示直接藥敏報告中頭孢類需注意。

本研究發現采用紙片擴散法進行血培養陽性物直接藥敏試驗，革蘭陰性菌在孵育8 h就可以讀取明顯的抑菌圈，而革蘭陽性菌中葡萄球菌屬在8 h時能夠看到不明顯的抑菌圈，鏈球菌則需要24 h。大部分臨床微生物實驗室夜間無專業人員處理標本，而僅有值班人員負責標本接種，通常血培養陽性瓶在早上集中處理，涂片染色鏡檢后進行直接藥敏試驗，革蘭陰性菌到下午下班前就能夠給臨床發放初步報告，比標準報告時間提前36 h，革蘭陽性菌則在次日早上發放報告，比標準報告時間提前24 h，這為臨床及時、準確地目標性抗感染治療提供了可靠的實驗室依據。

本研究結果提示利用血培養陽性物采用紙片擴散法進行直接藥敏試驗不僅能夠快速、準確地為臨床提供初步藥敏結果，而且能夠節約成本，操作簡便，易于臨床推廣。但是對于直接藥敏試驗中需要注意的問題，如革蘭陽性菌中克林霉素的誘導耐藥、革蘭陰性菌中頭孢類抗菌藥物的結果解釋等仍需引起實驗室重視。總之，血培養陽性物直接進行藥敏試驗能夠為合理使用抗菌藥物提供及時、可靠的指導。

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Evaluation of direct susceptibility testing for positive blood cultures*

DARong1，WANGWei2△，LIFang1，YUANJing1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710061,China)

Objective To explore the diagnostic value of direct susceptibility testing in blood stream infection by comparing the results of direct susceptibility test with standard susceptibility test of positive blood culture.Methods Positive blood culture specimens in the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University were collected from December 2014 to February 2015,besides the standard susceptibility testing,according to the results of smear staining,disc diffusion susceptibility tests were carried out for the Gram-positive cocci and Gram-negative rods.Rates of consistency,very major errors,major errors and minor errors of direct susceptibility test compared to standard susceptibility test were analyzed.Results Altogether,101 isolates and 875 organism/antibiotic combinations were evaluated.With regard to Gram-positive cocci,agreement between both methods was found in 94.3% of cases,with 0.8% very major,0.4% major and 4.5% minor errors.For Gram-negative rods,agreement was found in 94.1% of cases,with 0.0% very major,3.7% major and 2.2% minor errors.Agreement between both methods was 100.0% for linezolid,tetracycline,teicoplanin and vancomycin in Gram-positive cocci,imipenem and meropenem in Gram-negative rods.Minor errors occurred in fluoroquinolone for Gram-positive cocci and Gram-negative rods.Very major error occurred in clindamycin for Gram-positive cocci.Low consistent rate was found in cephalosporins antibiotics for Gram-negative rods,and major error occurred often.Conclusion Using positive blood culture for direct susceptibility test by disc diffusion susceptibility tests can not only provide rapid and accurate preliminary susceptibility results,but also save costs.Therefore，it can be widely used in clinical.

blood culture; direct susceptibility testing; evaluation

國家自然科學基金資助項目(81000767)。

答嶸，女，博士，主管技師，主要從事臨床微生物學研究。△

，E-mail：wei_wangdoc@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.001

A

1672-9455(2015)20-2971-03

2015-03-01

2015-06-06)