塵螨疫苗免疫治療下調哮喘小鼠氣道IL-17的表達*

呂 勤,楊小猛,肖小軍,陳 思,楊平常,劉志剛,張 敏△

(1.深圳大學第一附屬醫院呼吸內科 518035;2.深圳大學過敏反應和免疫學研究所 518060)

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·論 著·

塵螨疫苗免疫治療下調哮喘小鼠氣道IL-17的表達*

呂 勤1,楊小猛2,肖小軍2,陳 思2,楊平常2,劉志剛2,張 敏1△

(1.深圳大學第一附屬醫院呼吸內科 518035;2.深圳大學過敏反應和免疫學研究所 518060)

目的 探討塵螨疫苗免疫治療對塵螨過敏性哮喘小鼠氣道IL-17表達的影響。方法 24只BAL B/c小鼠隨機分為正常對照組(A組)、哮喘對照組(B組)和塵螨疫苗治療組(C組)，每組8只。A組小鼠始終采用生理鹽水處理；B、C組小鼠采用塵螨過敏原經腹腔建立塵螨過敏性哮喘小鼠模型后，B組采用生理鹽水治療，C組采用粉塵螨疫苗治療。治療7 d后采用塵螨粗提液霧化激發B、C組小鼠，末次激發24 h后取小鼠肺組織采用HE染色觀察炎性反應變化，取小鼠氣道采用免疫組化法分析IL-17濃度，取小鼠脾細胞培養上清液采用ELISA法測定IL-17濃度。結果 光鏡下可見B組小鼠肺組織結構紊亂、充血及水腫，有大量炎性細胞浸潤，而A、C組小鼠肺組織未見明顯病理變化。B組小鼠氣道IL-17表達明顯高于A、C組小鼠。同時B組小鼠脾細胞培養上清液IL-17濃度顯著高于A、C組小鼠(P<0.01)，而A、C組小鼠脾細胞培養上清液IL-17濃度差異無統計學意義(P>0.05)。結論 塵螨疫苗免疫治療可降低塵螨過敏性哮喘小鼠氣道IL-17的表達，減輕塵螨過敏性哮喘小鼠氣道炎性反應。

塵螨疫苗； 免疫治療； 哮喘； IL-17

白細胞介素17(IL-17)是近年來發現的主要由CD4+T細胞分泌的細胞因子，是一種較強的前炎性細胞因子，也是炎性反應的微調因子。IL-17是哮喘等過敏性疾病相關細胞因子網絡的重要成員之一，在T細胞激活、氣道的中性粒細胞募集及活化、氣道高反應等方面具有重要作用，參與了氣道炎性反應及氣道重塑。IL-17在哮喘的發生、發展中發揮重要作用，IL-17可以加重哮喘小鼠模型的氣道高反應性和氣道炎癥[1]，而IL-17基因缺陷的小鼠則不易誘發哮喘[2]。粉塵螨變應原是誘導哮喘和其他過敏反應疾病中最重要的變應原之一[3-4]，塵螨疫苗免疫治療是目前唯一對因治療過敏哮喘的有效方法，而塵螨疫苗免疫治療對哮喘患者氣道IL-17表達的影響尚不清楚，本研究擬建立粉塵螨過敏性哮喘小鼠模型，并采用塵螨疫苗免疫治療，研究塵螨疫苗免疫治療對哮喘小鼠模型氣道IL-17表達的調節作用，從而為治療哮喘提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 BAL B/c小鼠(雌性，4～6周齡，SPF級)購自廣東省實驗動物中心，飼養于深圳大學醫學院SPF級動物實驗室。小鼠IL-17檢測試劑盒購自美國Biolegend公司(ELISA法)，小鼠IL-17單克隆抗體購自美國Santa公司，免疫組化通用試劑盒購自日本DAKO公司，HE染色試劑盒購自珠海貝索公司。

1.2 方法

1.2.1 粉塵螨粗蛋白的提取 將研缽、勻漿器洗凈烘干備用。稱取-20 ℃保存的粉塵螨4 g，倒入研缽中，用液氮充分研磨成粉末，轉移到勻漿器中，加入5 mL PBS緩沖液和適量的蛋白酶抑制劑，冰上操作，充分勻漿2 h，然后4 ℃下攪拌2 h。4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，吸取中間層蛋白，避免吸到最上層的脂質和沉淀。再按照上述方法離心2～3次，直到溶液完全澄清。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，經0.22 μm的無菌濾膜過濾，以去除雜質和細菌，-80 ℃保存備用。

1.2.2 粉塵螨過敏性哮喘小鼠模型的建立及實驗方案 將24只BAL B/c小鼠隨機分成正常對照組(A組)、哮喘對照組(B組)和塵螨疫苗治療組(C組)，每組8只。A組始終采用生理鹽水處理，B、C組小鼠于第0、7、14天每只腹腔注射200 μL致敏液(含塵螨粗蛋白50 μg、氫氧化鋁佐劑2 mg)致敏。第28天后，B組用生理鹽水200 μL代替致敏液，C組用粉塵螨疫苗100 μg+2 mg氫氧化鋁佐劑，腹腔注射，每2 d注射1次，連續8次。1周后，B、C組小鼠置于自制小鼠霧化吸入箱中，以10 μg/mL塵螨粗提液(以PBS稀釋)霧化吸入激發，每天霧化30 min，連續霧化7 d，觀察并記錄小鼠哮喘發作情況。

1.2.3 氣道高反應性測定 小鼠最后一次激發24 h后開始試驗，將3組實驗小鼠分別裝入4個相同容器內，首先用PBS霧化噴入4個容器中，用于測量基礎增強呼吸間歇(Penh)值作為氣道反應性變化的指標；再依次霧化噴入6.25、12.5、25、50、100 mg/mL醋甲膽堿，每次霧化噴入后5 min記錄1次Penh值，每2個濃度的檢測之間有1個短暫的間歇，使呼吸強度回到基線水平。以PBS激發的Penh值為基礎值，繪制不同醋甲膽堿濃度激發下Penh值的變化百分比曲線，觀察Penh值的變化。

1.2.4 氣道和肺部病理變化及IL-17濃度分析 取氣道和右肺中葉于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中固定48 h，石蠟包埋，切片(厚度3 μm)。HE染色法觀察病理變化，嚴格按免疫組化法試劑盒說明書觀察IL-17濃度變化。

1.2.5 脾細胞培養上清液IL-17濃度的測定 無菌條件下取出小鼠脾臟，過無菌的200目濾網，用RPMI-1640不完全培養基重懸脾細胞，加入EDTA-NH4Cl紅細胞裂解液，離心收集脾細胞。然后再用含100 mg/L胎牛血清、100 U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基重懸脾細胞制成脾細胞懸液，24孔培養板培養脾細胞，每孔加2 mL，細胞密度為5×106/孔，加入刀豆蛋白(每孔200 μg)刺激脾細胞，同時設立陰性對照組，恒溫培養箱培養72 h，收集培養液，4 ℃條件下1 500 r/min離心5 min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書操作，觀察IL-17濃度變化。

2 結 果

2.1 3組小鼠氣道高反應性比較 當醋甲膽堿濃度大于或等于25 mg/mL時，隨醋甲膽堿濃度升高，3組小鼠Penh值均不斷升高；B組氣道高反應性均顯著高于A組(P<0.01)和C組(P<0.01)；C組Penh值均略高于A組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 3組小鼠氣道和肺部病理變化比較 A組切片結構完整清晰，支氣管纖毛排列整齊，無水腫和炎性滲出，氣管和血管周圍未見炎性細胞浸潤(圖2A)；B組肺組織切片肺泡網狀結構消失，結構紊亂、管腔內炎性滲出增多，周圍有大量炎性細胞浸潤，肺組織有明顯水腫和損傷(圖2B)；C組肺組織基本恢復網狀結構，較哮喘組完整，支氣管周圍炎性細胞浸潤較B組明顯減少，C組水腫及炎性滲出亦明顯減少(圖2C)。

圖1 3組小鼠氣道高反應性比較

圖2 3組小鼠氣道和肺部病理變化比較 小鼠肺組織HE染色圖

2.3 3組小鼠氣道和肺組織IL-17濃度比較 圖3中A、B、C分別為A組、B組、C組小鼠氣道和肺組織的免疫組化圖，由圖3可見，B組小鼠IL-17濃度明顯高于A組，經塵螨疫苗治療后，C組小鼠氣道IL-17表達明顯減弱。

注：箭頭所示為IL-17表達陽性。

圖3 3組小鼠氣道和肺組織IL-17濃度免疫組化圖

2.4 3組小鼠脾細胞培養上清液IL-17濃度比較 A、B、C組小鼠脾細胞培養上清液IL-17濃度分別為(48.27±4.14)、(85.13±2.36)、(51.21±2.32)pg/mL。B組顯著高于A組(t=21.878,P<0.01)和C組(t=28.990,P<0.01)；C組略高于A組，但差異無統計學意義(t=1.752,P>0.05)。

3 討 論

過敏性哮喘是一種以肺部嗜酸性粒細胞浸潤、黏液過度分泌、對特異性抗原產生氣道高反應性為特征的慢性氣道炎性疾病[5]，其主要病理特征為氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑。IL-17、IL-4、IL-10等多種細胞因子參與過敏性哮喘的進程，影響哮喘發生和發展，貫穿疾病始終。其中IL-17通過募集中性粒細胞、巨噬細胞浸潤及誘導黏液分泌等參與哮喘的病理過程，促進炎性反應，與哮喘的加重密切相關[6]。IL-17是一種主要由CD4+T細胞、嗜酸性粒細胞等分泌的前炎性細胞因子，參與機體多種炎性疾病的發生和發展，特別是與肺部感染、哮喘等疾病有著密切的關系，IL-17可以通過促進氣道組織纖維化進而引起呼吸道重塑，促進哮喘的發生、發展。

塵螨疫苗是目前唯一對因治療哮喘的有效藥物，用于治療兒童過敏性哮喘，全身不良反應發生率相對較低，安全性較高，有臨床實用價值[7]，而塵螨疫苗免疫治療對哮喘患者氣道IL-17表達的影響尚不清楚。本研究采用塵螨粗蛋白和氫氧化鋁佐劑按常規方法構建哮喘小鼠模型，使用塵螨疫苗進行免疫治療并測定氣道高反應性，結果發現B組氣道高反應性均顯著高于A組和C組，而經塵螨疫苗治療的C組小鼠的哮喘癥狀如煩躁不安、毛發豎起、呼吸加快加深等均有所改善，提示本研究成功建立了塵螨過敏性哮喘小鼠模型，塵螨疫苗對哮喘有效且可以降低氣道高反應性。

有研究顯示，IL-17在哮喘中發揮著重要作用，IL-17表達水平與氣道高反應性和臨床嚴重程度有關[8-10]；卵清蛋白致敏性支氣管哮喘小鼠肺組織中IL-17 mRNA和蛋白水平均高于正常小鼠[11]。本研究發現B組小鼠脾細胞培養上清液中IL-17濃度較A組和C組均顯著升高，而C組小鼠脾細胞培養上清液中IL-17濃度與A組相近，同時肺組織病理及免疫組化結果亦證實塵螨疫苗治療后的C組小鼠氣道和肺組織IL-17濃度顯著低于B組，提示IL-17在哮喘發生和發展中起著重要作用，塵螨疫苗免疫治療可能通過降低IL-17的表達減輕哮喘炎性反應及氣道高反應性。

[1]Mizutani N,Nabe T,Yoshino S.IL-17A promotes the exacerbation of IL-33-induced airway hyperresponsiveness by enhancing neutrophilic inflammation via CXCR2 signaling in mice[J].J Immunol,2014,192(4):1372-1384.

[2]Choi JP,Kim YS,Tae YM,et al.A viral PAMP double-stranded RNA induces allergen-specific Th17 cell response in the airways which is dependent on VEGF and IL-6[J].Allergy,2010,65(10):1322-1330.

[3]Sade K,Roitman D,Kivity S.Sensitization to Dermatophagoides,Blomia tropicalis,and other mites in atopic patients[J].J Asthma,2010,47(8):849-852.

[4]陳代雄,周平坤,冉丕鑫,等.屋塵螨和粉塵螨主要變應原的篩選和分析[J].中國熱帶醫學,2009,9(2):232-234.

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[6]Iwakura Y,Ishigame H,Saijo S,et al.Functional specialization of interleukin-17 family members[J].Immunity,2011,34(2):149-162.

[7]柴若楠,林小平,謝華,等.阿羅格塵螨疫苗治療兒童哮喘安全性評價[J].臨床軍醫雜志,2012,40(2):428-430.

[8]Barczyk A,Pierzchala W,Sozaska E.Interleukin-17 in sputum correlates with airway hyperresponsiveness to methacholine[J].Respir Med,2003,97(6):726-733.

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[11]胡斯明,羅雅玲,賴文巖,等.地塞米松對哮喘小鼠Th17細胞因子IL-17表達的影響[J].南方醫科大學學報,2009,29(6):1185-1188.

Dust mite vaccine immunotherapy down-regulate the level of IL-17 in asthma mice*

LYUQin1,YANGXiao-meng2,XIAOXiao-jun2,CHENSi2,YANGPing-chang2,LIUZhi-gang2,ZHANGMin1△

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospitalofShenzhenUniversity,Shenzhen,Guangdong518035,China;2.AllergiesandImmunologyInstitute,ShenzhenUniversity,Shenzhen,Guangdong518060,China)

Objective To investigate the effects of dust mite vaccine immunotherapy on the level of IL-17 in asthma mice.Methods 24 BAL B/c mice were randomly divided into the control group (group A),asthma group (group B) and dust mite vaccine treatment group (group C),with 8 mice in each group.Group A were treated by normal saline.Group B and C received intraperitoneal injection of dust mite allergen to establish dust mite allergic asthma mice model.Group B were treated by normal saline.Group C were treated by dust mite vaccine.Group B and C were stimulated by allergens extracted from whole house dust mite after 7 d treatment.24 h after the last challenge,lung tissue were obtained to observe the inflammatory changes using HE staining; airway were obtained to analyze the level of IL-17 using immunohistochemical method; splenocytes were obtained and cultured,and the level of IL-17 in the supernatant were tested using ELISA.Results Lung tissues in group B showed structural disorder,congestive and edema,inflammatory cells infiltration at light microscopy level,but lung tissues in group A and C showed little pathological changes.IL-17 expression in airway in group B was higher than those in group A and C significantly.Meanwhile,the levels of IL-17 in the supernatant in group B were higher than those in group A and C obviously(P<0.01);and there was no significant difference between group A and C(P>0.05).Conclusion Dust mite immunotherapy vaccine might lessen airway inflammation in dust mite allergic asthma mice through down-regulating the expression of IL-17 in airway in asthma mice.

dust mite vaccine; immunotherapy; asthma; IL-17

國家自然科學基金資助項目(81300028、31328014);廣東省高等學校國際暨港澳臺科技合作創新平臺項目(2012gjhz0009);廣東省深圳市科技計劃項目(JCYJ20120613173913654、JCYJ20130329110735981、JCYJ20120613173233810)。

呂勤，女，碩士，主治醫師，主要從事呼吸內科基礎與臨床研究。△

，E-mail：sysu_microbiology@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.002

A

1672-9455(2015)20-2974-02

2015-03-25

2015-07-02)