三種方法提取血清miRNA效果的比較*

陳昌國，陳秋圓,2，郭建巍，馬志家，劉 敏，趙強元，張雅芳

(1.中國人民解放軍海軍總醫院檢驗科,北京 100048；2.北方醫學院檢驗醫學系，河北張家口 075000)

?

·論 著·

三種方法提取血清miRNA效果的比較*

陳昌國1，陳秋圓1,2，郭建巍1，馬志家1，劉 敏1，趙強元1，張雅芳1

(1.中國人民解放軍海軍總醫院檢驗科,北京 100048；2.北方醫學院檢驗醫學系，河北張家口 075000)

目的 比較Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA的效果。方法 分別選取2例健康人、2例肺炎患者和2例肺癌患者血清，以Let-7a-5p作為目標mRNA，線蟲Cel-miR-39-3p作為內參，分別采用Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法提取血清miRNA，以Let-7a-5p及Cel-miR-39-3p特異性引物進行反轉錄PCR，以反轉錄PCR產物為模板運用SYBGreen Ⅰ法進行熒光定量PCR檢測。結果 Trizol法與蛋白酶K消化+Trizol法均能有效提取到血清miRNA，而沉淀裂解法由于沒有對血漿中的RNA進行富集故提取效果不佳。Trizol法提取較蛋白酶K消化+Trizol法相比，可以減少蛋白酶K的消化時間且提取效果更好，并且血清與Trizol試劑的體積比為200∶600時效果相對較好。三種方法檢測Cel-miR-39-3p的Ct值基本一致。Trizol法和蛋白酶K消化+Trizol法在提取過程中加入的內參丟失較少。結論 Trizol法作為總RNA提取的手段適用于血清miRNA提取，通過調整血清與Trizol試劑的用量可使提取到的血清miRNA能夠滿足試驗需要。

miRNA; Let-7a-5p; Cel-miR-39-3p; 提取

miRNA是近年來發現的一類18～24 nt的單鏈非編碼RNA小分子，最早由Lee等[1]在秀麗新小桿線蟲中首次發現，其主要通過與靶RNA分子以不完全互補和完全互補的方式影響基因的表達和穩定性，從而參與調控多種生物學行為，如：發育的進程、干細胞分化、細胞凋亡、疾病及腫瘤的發生[2-3]。miRNA是一類自然形成的小非編碼RNA，50%以上的miRNA位于與癌癥相關的染色體區域，多種miRNA與腫瘤的發生、發展、轉移有重要的關系，因此有學者將miRNA命名為“oncomirs”[4]。血清miRNA因具有取材方便、對冷熱穩定、保存時間長、表達與腫瘤的診斷、分期、進展及預后相關等特點被認為是一種潛在的腫瘤標志物[5-9]。本研究旨在通過比較三種不同的血清miRNA提取方法，為后續血清miRNA相關研究奠定基礎，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取正常體檢且各項指標正常的健康體檢者2例，依據《肺炎診斷(WS 382-2012)指南》經呼吸科臨床醫生診斷為肺炎的患者2例，以及依據《013ACCP肺癌的診斷與治療指南(第3版)》經病理診斷為肺癌的患者2例。采集各研究對象全血標本3 mL離心后收集血清。

1.2 儀器與試劑 普通PCR儀器為ABI公司GeneAmp?PCR System 9700 PCR儀,熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne PCR儀。SYBR?Green QPCR Master Mix 購自安捷倫公司(批號0006148864)；RevertAid Fist Strand cDNA Synthesis Kit(批號00127244)購自Thermo SCIENTIFIC公司；miRNA特異性反轉錄引物、PCR引物及線蟲Cel-miR-39-3p內參(20 fmol/sample)miRNA購自廣州瑞博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Trizol法提取血清miRNA 200 μL血清中加入500 μL Trizol，渦旋振蕩30 s，室溫靜置5 min；加200 μL三氯甲烷，劇烈顛倒混勻45 s，室溫靜置5 min；4 ℃ 13 000 r/min離心30 min，小心將上清液移至新的1.5 mL離心管；加等體積的異丙醇至上清液中，顛倒混勻，置-20 ℃靜置30 min；4 ℃ 13 000 r/min離心30 min,沉淀總RNA;吸棄上清液,沉淀用體積分數75% 乙醇洗1 次;4 ℃,以7 500 r/min離心5 min，沉淀RNA；吸凈乙醇，50 μL DEPC水溶解RNA。

1.3.2 蛋白酶消化法提取血清miRNA 取200 μL 血漿樣本于1.5 mL離心管中，加入10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，56 ℃消化30 min后進行RNA提取，步驟同1.3.1。

1.3.3 沉淀裂解法提取血清miRNA 取200 μL血漿樣本于1.5 mL離心管中，加入200 μL核酸提取液，渦旋振蕩15 s，室溫13 000 r/min離心10 min，棄上清液；在沉淀中加入50 μL核酸裂解液吹打混勻，渦旋振蕩15 s,100 ℃金屬浴加熱10 min，室溫13 000 r/min離心5 min，取上清液作為反轉錄PCR的模板。

1.3.4 反轉錄及熒光定量PCR反應體系及條件 采用Thermo SCIENTIFIC公司反轉錄試劑盒進行反轉錄，所有體系及步驟按照說明書進行操作，取2 μL反轉錄cDNA為模板以Let-7a-5p熒光定量PCR引物進行擴增。PCR反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環，收集熒光。

2 結 果

2.1 三種方法提取血清miRNA后Let-7a-5p及Cel-miR-39-3p檢測情況 三種方法提取的血清miRNA經熒光定量PCR檢測均使Let-7a-5p和Cel-miR-39-3p有效擴增，見圖1。

注：A為Let-7a-5p的PCR擴增曲線；B為Cel-miR-39-3p的PCR擴增曲線。

圖1 熒光定量PCR擴增曲線

2.2 三種方法提取血清miRNA后內參Ct值差異 三種方法提取血清miRNA過程中摻入25 fmol內參后，經過后續步驟操作，Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法、沉淀裂解法提取的miRNA中，Cel-miR-39-3p的擴增Ct值分別為26.3±1.5、27.4±1.3、28.2±1.8，差異無統計學意義(P=0.12)。

2.3 不同血清用量與Trizol試劑提取血清miRNA的效率 對分別設置3個不同的血清與Trizol 試劑體積比(100∶600、200∶600及300∶600)，比較不同血清用量與Trizol試劑提取血清miRNA的效率，同時檢測Let-7a-5p和Cel-miR-39-3p，發現血清與Trizol試劑體積比為200∶600時，提取效果較好(綠色曲線)，熒光定量PCR擴增曲線見圖2。

注：A為Let-7a-5p的PCR擴增曲線；B為Cel-miR-39-3p的PCR擴增曲線。

圖2 不同血清用量與Trizol試劑提取血清miRNA的效率比較

3 討 論

研究顯示，miRNA表達與腫瘤的診斷、分期、進展及預后相關，其表達水平的檢測有可能為觀察臨床療效、判斷腫瘤是否復發及預后提供幫助。此外，miRNA廣泛存在于淚液、乳汁、唾液等多種體液中，在血漿、血清中具有良好的穩定性，在多次反復凍融、24 h室溫放置、強酸、強堿、DNA酶、RNA酶等惡劣情況下仍不被降解且保持相對穩定的水平[10-11]，在血清和血漿中的表達不存在差異，外周血miRNA的表達亦不存在明顯的性別、個體差異[5,9,12],這些均提示miRNA有潛力作為腫瘤標志物應用于腫瘤的早期診斷、療效判定及轉移復發等病情的判斷指標[7-8]。

目前，常用的血清miRNA 的提取方法有柱分離法和Trizol法，相對于柱分離技術而言，Trizol法能夠較好地保留包括miRNA 在內的小片段成分，但該方法主要用于細胞總mRNA提取，并未考慮miRNA與mRNA在物理性質及存在方式上的差別。趙德堯等[13]曾嘗試在Trizol法抽提miRNA前對標本進行加熱、加入十二烷基磺酸鈉(SDS)、超聲裂解及蛋白酶K消化等處理，發現加熱或加入SDS能夠顯著提高血清miRNA的提取效率[13]。為進一步開展血清miRNA的相關研究工作，本課題組分別采用Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法及沉淀裂解法抽提血清miRNA,發現經典的Trizol法能夠有效提取到血清miRNA并且通過調整血清與Trizol試劑的比例可滿足實驗的要求；蛋白酶K消化+Trizol法并未提高提取效率并且操作時間稍長。miRNA主要以蛋白復合體的形式存在，提高miRNA 提取效率的關鍵是使miRNA從蛋白復合體上解離下來，依據該特點本研究嘗試使用臨床提取核酸用的核酸沉淀液及核酸提取液抽提血清miRNA，實驗結果證實該方法不適用于血清miRNA的提取。經熒光定量PCR檢測，三種方法提取物中，內參Cel-miR-39-3p的Ct值無明顯差異，說明三種抽提方法均能有效保留加入的內參[14-15]。本研究成功地利用Trizol法、蛋白酶K消化+Trizol法提取到血清miRNA，并且Trizol法提取效果相對更好，利用熒光定量PCR進行檢測的結果能滿足實驗要求。

[1]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[2]Macfarlane LA,Murphy PR.MicroRNA:biogenesis,function and role in cancer[J].Curr Genomics,2010,11(7):537-561.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell,2009,136(2):215-233.

[4]Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[5]Cortez MA,Welsh JW,Calin GA.Circulating microRNAs as noninvasive biomarkers in breast cancer[J].Recent Results Cancer Res,2012,195:151-161.

[6]Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

[7]Wang J,Zhang KY,Liu SM,et al.Tumor-associated circulating microRNAs as biomarkers of cancer[J].Molecules,2014,19(2):1912-1938.

[8]Shen J,Stass SA,Jiang F.MicroRNAs as potential biomarkers in human solid tumors[J].Cancer Lett,2013,329(2):125-136.

[9]Cortez MA,Bueso-Ramos C,Ferdin J,et al.MicroRNAs in body fluids--the mix of hormones and biomarkers[J].Nat Rev Clin Oncol,2011,8(8):467-477.

[10]Grasedieck S,Scholer N,Bommer M,et al.Impact of serum storage conditions on microRNA stability[J].Leukemia,2012,26(11):2414-2416.

[11]Mraz M,Malinova K,Mayer J,et al.MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,390(1):1-4.

[12]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(30):10513-10518.

[13]趙德堯，杜權，郭江峰，等.血漿microRNA提取技術優化[J].浙江理工大學學報,2010,27(4):595-599.

[14]Kroh EM,Parkin RK,Mitchell PS,et al.Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR(qRT-PCR) [J].Methods,2010,50(4):298-301.

[15]Arroyo JD,Chevillet JR,Kroh EM,et al.Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(12):5003-5008.

Comparing the serum miRNA extraction effect of three methods*

CHENChang-guo1,CHENQiu-yuan1,2,GUOJian-wei1,MAZhi-jia1,LIUMin1,ZHAOQiang-yuan1,ZHANGYa-fang1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China；2.DepartmentofLaboratoryMedicine,theNorthMedicalCollege,Zhangjiakou，Hebei075000，China)

Objective To compare the serum miRNA extracting efficiency of Trizol method,protease K digestion combined with Trizol method and precipitation pyrolysis method.Methods 2 healthy persons,2 pneumonia patients and 2 lung cancer patients were enrolled in the study and their serum samples were collected.miRNA were extracted from serum samples respectively by using Trizol method,protease K digestion combined with Trizol method and precipitation pyrolysis method.Let-7a-5p was the objective miRNA of detection,with Cel-miR-39-3p as the incorporation of spike-in reference.The specific primers of Let-7a-5p (objective miRNA) and Cel-miR-39-3p (internal reference) were used in reverse transcription PCR.The products of reverse transcription PCR were used as templates for SYBGreen Ⅰ fluorescence quantitative PCR assay.Results The Trizol method and protease K digestion combined with Trizol method could effectively extract serum miRNA,but precipitation pyrolysis method was not so suitable for extraction of serum miRNA.Trizol method was better than protease K digestion combined with Trizol method,which could save the proteinase K digestion time and had better extracting effects.When the volume ratio of serum and Trizol reagent was 200∶600,the extracting effect of Trizol method was best.The Ct values of Cel-miR-39-3p extracted by three methods were basically the same.There was a little loss of internal reference in the extraction process of Trizol method and protease K digestion combined with Trizol method.Conclusion The Trizol method as the extracting method of total RNA is suitable for miRNA extraction from serum.The extracted serum miRNA can meet the detection needs by adjusting the dosage of serum and Trizol reagent.

miRNA; Let-7a-5p; Cel-miR-39-3p; extracting

國家自然基金青年項目(81401311)；首都臨床特色應用研究項目[吳階平(Z141107006614009)]。

陳昌國， 男，博士，主管技師，主要從事分子免疫相關研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.003

A

1672-9455(2015)20-2976-03

2015-03-06

2015-06-12)