血小板相關抗體及淋巴細胞亞群檢測在兒童原發免疫性血小板減少癥早期治療效果評估中的作用*

張 雪，陳振萍，鞏文玉

(首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心，兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點實驗室，兒科學國家重點學科 100045)

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·論 著·

血小板相關抗體及淋巴細胞亞群檢測在兒童原發免疫性血小板減少癥早期治療效果評估中的作用*

張 雪，陳振萍△，鞏文玉

(首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心，兒童血液病與腫瘤分子分型北京市重點實驗室，兒科學國家重點學科 100045)

目的 研究血小板相關抗體(PA-Ig)水平及淋巴細胞亞群檢測在原發免疫性血小板減少癥(ITP)患兒早期臨床治療效果評估中的作用。 方法 采用流式細胞術檢測111例ITP患兒和27例健康兒童(對照組)的PA-IgG、PA-IgM、PA-IgA水平及淋巴細胞亞群，同時對患兒早期治療效果進行評估。結果 根據早期治療效果，將ITP患兒分為完全反應組、有效組、無效組。ITP患兒各組PA-IgG、PA-IgM水平較對照組均有明顯升高(P<0.05)，無效組PA-IgA水平顯著高于對照組(P<0.05)，完全反應組和有效組PA-IgA水平與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。完全反應組PA-IgG、PA-IgM水平明顯低于有效組和無效組(P<0.05)，有效組PA-IgG、PA-IgM水平明顯低于無效組(P<0.05)。無效組PA-IgA水平最高。完全反應組、有效組及無效組CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+及CD19+表達水平與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，但ITP患兒各組CD16+/CD56+表達水平與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。結論 ITP患兒血液中PA-Ig高水平表達及多種抗體混合高表達提示早期治療效果欠佳，淋巴細胞亞群結果提示ITP患兒存在細胞及體液免疫功能異常，這將為調整治療方案提供重要的實驗室依據。

血小板相關抗體； 淋巴細胞亞群； 原發免疫性血小板減少癥； 兒童

原發免疫性血小板減少癥(ITP)是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，以免疫介導的血小板破壞為特征，臨床癥狀以皮膚黏膜出血為主，嚴重者可有內臟出血，甚至顱內出血，是臨床常見的出血性疾病，在兒童及青少年中較多見，年發病率為1.9/100 000～6.4/100 000[1],患者發病前常有急性病毒感染或免疫接種史[2]。目前，ITP的臨床診斷為排他性診斷，沒有特異性指標和統一的“金標準”，診斷往往需要根據臨床表現及實驗室相關檢查[3-5]。本研究通過檢測ITP兒童血小板相關抗體(PA-Ig)水平及淋巴細胞亞群分子表達水平的變化，進一步研究ITP患兒的發病特點，以期為臨床診斷提供實驗室依據。同時在患兒治療期間，根據PA-Ig水平及淋巴細胞亞群分子表達情況及時地調整治療方案，為今后進行更科學、合理的個體化治療提供實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年7～12月首都醫科大學附屬北京兒童醫院血液腫瘤中心收治的111例新診斷ITP患兒作為研究對象，臨床診斷均符合兒童ITP診斷標準[6]，且骨髓細胞形態學檢查符合ITP骨髓象特點，檢測前未使用激素、免疫抑制劑等藥物治療。其中男性60例，女性51例，中位年齡4.0歲(0.5～15.0歲)。另選取同期健康體檢兒童27例作為對照組，其中男性15例，女性12例，中位年齡4.0歲(2.0～15.0歲)。

1.2 儀器與試劑 BD FACS Calibur流式細胞儀。主要試劑包括：PBS緩沖液；PA-Ig檢測試劑盒(美國聯科公司)；淋巴細胞功能檢查試劑盒(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 PA-Ig水平檢測 所有納入兒童清晨空腹，使用含EDTA-K2的真空取血管采集靜脈血2 mL，輕微混勻。800 r/min離心15 min，將上清液(富血小板血漿)轉移到流式標準管中。將流式標準管2 000 r/min離心3 min，棄血漿，PBS緩沖液洗滌血小板3次，每次2 000 r/min離心3 min。用PBS緩沖液將血小板濃度調整為(5～10)×109/L。取3支流式標準管，每管加入已調整血小板濃度的標本100 μL，分別加入抗PA-IgG、抗PA-IgM、抗PA-IgA抗體各20 μL，同時每管加入抗CD41抗體20 μL，混勻，室溫避光靜置15 min。使用PBS緩沖液洗滌檢測標本1次，2 000 r/min離心3 min，棄上清液。流式標準管中加入PBS緩沖液0.5 mL，立即上機檢測。

1.3.2 淋巴細胞亞群分子表達水平檢測 所有納入兒童清晨空腹，使用含EDTA-K2的真空取血管采集靜脈血2 mL，輕微混勻。取流式標準管2支，各加入全血標本100 μL，同時分別加入CD3/CD16/CD56/CD45/CD19抗體、CD3/CD8/CD45/CD4抗體各20 μL，混勻，室溫避光靜置15 min。流式標準管分別加入紅細胞裂解液1 mL，室溫避光靜置10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。使用PBS緩沖液洗滌檢測標本1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。流式標準管中加入PBS緩沖液0.5 mL，立即上機檢測。

1.4 ITP患兒早期治療及療效判斷標準 臨床治療參考《兒童原發性免疫性血小板減少癥診療建議》(以下簡稱《診療建議》)[6]，采用腎上腺糖皮質激素及丙種球蛋白治療方案。治療1周后，根據《診療建議》對早期治療效果進行評價：(1)完全反應，治療后血小板計數(PLT)≥100×109/L，且沒有出血表現；(2)有效，治療后PLT≥30×109/L，并且至少比基礎PLT增加2倍，且沒有出血表現；(3)無效，治療后PLT<30×109/L或者PLT增加不到基礎值的2倍或者有出血表現。根據治療效果，將111例ITP患兒分為完全反應組、有效組、無效組。

2 結 果

2.1 ITP患兒早期治療效果 經治療，111例ITP患兒中，完全反應91例(完全反應組)、有效12例(有效組)、無效8例(無效組)。

2.2 各組PA-Ig水平比較 完全反應組、有效組、無效組PA-IgG、PA-IgM水平均較對照組有明顯升高(P<0.05)；完全反應組、有效組PA-IgA水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，無效組PA-IgA水平較對照組明顯升高(P<0.05)。ITP患兒各組間比較發現，完全反應組PA-IgG、PA-IgM水平明顯低于有效組(P<0.05)，但兩組間PA-IgA差異無統計學意義(P>0.05)；完全反應組PA-IgG、PA-IgM、PA-IgA水平明顯低于無效組(P<0.05)。有效組PA-IgG、PA-IgM水平明顯低于無效組(P<0.05)，但兩組間PA-IgA差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組PA-Ig水平比較

2.3 各組淋巴細胞亞群分子表達水平比較 完全反應組、有效組及無效組CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+及CD19+水平與對照組差異均有統計學意義(P<0.05)，而CD16+CD56+水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。完全反應組、有效組及無效組間兩兩比較，CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD19+及CD16+/CD56+水平差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITP患兒淋巴細胞亞群分子表達比較±s)

3 討 論

有研究認為體液免疫和細胞免疫共同參與了ITP的發病機制，導致自身免疫功能紊亂[7-8]。T細胞異常活化，導致B細胞被激活，B細胞產生針對自身血小板的抗體，該抗體在血液循環中與血小板表面相關抗原結合，抗體分子的Fc段暴露，單核-巨噬細胞系統對血小板破壞[9]，導致外周血PLT減低。研究發現PA-Ig水平與全血PLT呈負相關[10]。

目前，PA-Ig檢測作為ITP的輔助診斷得到廣泛應用[11-12]，而通過流式細胞術檢測ITP患者體內PA-Ig水平，可以為臨床診斷及治療提供可靠的實驗室依據。本研究中，患兒采用統一的ITP治療方案，并通過早期治療效果觀察，發現患兒血液中PA-IgG、PA-IgM、PA-IgA高水平的表達明顯影響患兒血液中PLT的恢復。同時，本研究發現患兒體內單一PA-Ig水平增高時，其治療效果優于2種及以上PA-Ig水平增高時的治療效果，可能原因為患兒體內同時存在大量復雜PA-Ig時，激素免疫調節機制不理想，不能很好地抑制單核-巨噬細胞系統對血小板的清除并減少自身抗體產生，而丙種球蛋白不能完全封閉單核-巨噬細胞系統的Fc受體，使脾臟與其他免疫器官仍然可以清除結合了自身抗體的血小板，從而使血小板在體內破壞程度無法得到明顯改善[13]。因此，當ITP患兒血液中PA-Ig高水平表達或存在2種及以上PA-Ig水平增高時，其早期治療效果往往不理想，外周血PLT達不到ITP治療的預期標準。本研究中，無效組患兒體內PA-Ig相對復雜，且抗體水平明顯高于其他組，因此該組患兒經過早期治療，外周血PLT仍很難恢復，需要進一步調整治療方案，延長治療時間。

ITP的免疫異常是其發病機制的核心，而T、B淋巴細胞的功能狀態在ITP的發生機制中起著關鍵作用。T細胞亞群是參與細胞免疫的主要成分，同時在抗原刺激下可以活化產生相應的細胞因子，執行細胞免疫及免疫調節功能。其中CD4+T細胞為免疫應答中的主要反應細胞，具有增強和擴大其他免疫細胞功能的作用，CD8+T細胞可對靶細胞產生細胞介導的細胞毒作用，同時對CD4+T細胞具有調節性免疫抑制作用。本研究中，ITP患兒各組CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+表達水平與對照組均存在明顯差異，提示T淋巴細胞免疫調節機制的紊亂，在ITP發生、發展過程中起重要作用[14-15]。同時，ITP患兒各組CD19+表達水平明顯高于對照組，提示B淋巴細胞數量增多，而異常增殖的B淋巴細胞可以產生過多的自身抗體，附著在血小板表面，進而導致血小板的破壞增多。

綜上所述，聯合檢測ITP患兒外周血PA-Ig及淋巴細胞亞群，可以及時了解患兒體內PA-Ig類型、水平及機體免疫調節等情況，這將為今后及時有效地進行ITP患兒個體化治療和早期療效評估，減少患兒治療風險提供可能的實驗依據。

[1]Terrell DR,Beebe A,Vesely SK,et al.The incidence of immune thrombocopenic purpura in children and adults:a critical review of published reports[J].Am J Hematol,2010,85(2):174-180.

[2]何志旭,尚峰.國內外原發免疫性血小板減少癥診斷標準的比較[J].實用兒科臨床雜志,2006,21(15):1035-1036.

[3]British Committee for Standards in Haematology General Haematology Task Force.Guidelines for the investigation and management of idiopathic thrombocytopenic purpura in adults,children and in pregnancy[J].Br J Haematol,2003,120(4):574-596.

[4]Geddis AE,Balduini CL.Diagnosis of immune thrombocytopenic purpura in children[J].Curr Opin Hematol,2007,14(5):520-525．

[5]秦平,侯明．2012版成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識解讀[J]．臨床血液學雜志,2013,26(3):151-155.

[6]中華醫學會兒科學分會血液學組,中華兒科雜志編輯委員會.兒童原發性免疫性血小板減少癥診療建議[J].中華兒科雜志,2013,51(5):382-384.

[7]Cui G,Liu X,Yao J.The effect of costimulatory factors in the pathogenesis of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Huazhong Univ Sci Technology Med Sci,2003,23(4):352-355.

[8]馬肖容,陳銀霞,張王剛,等.特發性血小板減少性紫癜患者外周血共刺激分子的表達及與血小板抗體關系的臨床研究[J].中國實驗血液學雜志,2009,17(2):483-486.

[9]Johnsen J.Pathogenesis in immune thrombocytopenia:new insights[J].Hematol Am Soc hematol Educ Program,2012,2012(1):306-312.

[10]Iris TR,Jukka RA,Bernward ZE,et al.Initial management of children with newly diagnosed idiopathic thrombocytopenic purpura in the Nordic countries[J].Acta Pediatr,2006,95(6):726-731.

[11]Provan D,Stasi R,Newland AC,et al.International consensus report on the management of primary immune thrombocytopenia[J].Blood,2010,115(5):168-186.

[12]中華醫學會血液學分會血栓與止血學組．成人原發免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)[J]．中華血液學雜志,2011,32(3):214-216.

[13]竺曉凡.兒童原發免疫性血小板減少癥診斷治療原則[J].實用兒科臨床雜志,2009,24(15):1214-1216.

[14]鐘永根,封蔚瑩,羅洪強,等.特發性血小板減少性紫癜患者外周血T細胞Fas-FasL和caspase-3凋亡相關蛋白的表達及其意義[J].中華血液學雜志,2008,5(29):329-332.

[15]Gu D,Chen Z,Zhao H,et al.Th1(CXCL10) and Th2(CCL2) chemokine expression in patients with immune thrombocytopenia[J].Hum Immunol,2010,71(6):586-591.

The effect of platelet-associated antibodies and lymphocyte subsets levels on early treatment evaluation in primary immune thrombocytopenia children*

ZHANGXue,CHENZhen-ping△,GONGWen-yu

(HematologyOncologyCenter,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity；BeijingKeyLaboratoryofPediatricHematologyOncology；NationalKeyDisciplineofPediatrics,MinistryofEducation,Beijing100045,China)

Objective To study the effect of platelet-associated antibodies (PA-Ig) and lymphocyte subsets levels on early treatment evaluation in children with primary immune thrombocytopenia (ITP).Methods Flow cytometry was used to detect the levels of PA-IgG,PA-IgM,PA-IgA and lymphocyte subsets molecule expression in 111 cases of newly diagnosed children ITP and 27 healthy children (control group).In addition,the effect of early treatment in children ITP was assessed.Results The ITP children were divided into complete response (CR) group,partial response (PR) group and no response (NR) group,according to the early treatment effect.The levels of PA-IgG and PA-IgM in CR group,PR group and NR group were significantly higher than those in the control group (P<0.05).Compared to the control group,PA-IgA level in NR group was significant higher (P<0.05),however,there was no statistical difference of PA-IgA levels observed in CR group and PR group (P>0.05).The levels of PA-IgG and PA-IgM in CR group were statistical lower than those in PR group and NR group (P<0.05).The levels of PA-IgG and PA-IgM in PR group were significantly lower than NP group (P<0.05).The PA-IgA level of NP group was the highest.Compared with control group,there were significant difference of CD3+,CD3+/CD4+,CD3+/CD8+and CD19+in CR group,PR group and NR group (P<0.05).However,there was no significant difference of CD16+/CD56+between each ITP subgroups and control group (P>0.05).Conclusion Higher PA-Ig levels and a mixed high expression of PA-Ig in ITP children often predict poor outcome of early treatment,and lymphocyte subsets indicate cellular and humoral immune dysfunction in ITP children,which would provide an important laboratory basis for the follow-up treatment and adjustment solution.

platelet-associated antibodies; lymphocyte subsets; primary immune thrombocytopenia; children

國家自然科學基金資助項目(81200351)；北京市自然科學基金資助項目(7152053)；北京市醫院管理局臨床醫學發展專項經費資助(ZY201404)。

，E-mail：chenzhenping@outlook.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.005

A

1672-9455(2015)20-2981-03

2015-03-15

2015-06-17)

作者介紹：張雪，男，本科，主管技師，主要從事臨床血液學檢驗工作。△