59例慢性淋巴細胞白血病分子遺傳學異常的FISH檢測*

傅 薔，林曉嵐，陳萬紫，陳加弟，黃慧芳

(福建醫科大學附屬協和醫院福建省血液病研究所/

?

·論 著·

59例慢性淋巴細胞白血病分子遺傳學異常的FISH檢測*

傅 薔，林曉嵐，陳萬紫，陳加弟，黃慧芳△

(福建醫科大學附屬協和醫院福建省血液病研究所/

福建省血液病學重點實驗室，福州 350001)

目的 探討間期熒光原位雜交(FISH)技術檢測慢性淋巴細胞白血病(CLL)常見分子遺傳學異常的意義。方法 采用CSF12(12p11.1～12q11.1)、D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)及p53(17p13.1)等5種探針對59例初診CLL患者的骨髓細胞進行間期FISH檢測，分析上述分子遺傳學異常與患者的臨床Binet分期、Ria分期及相關實驗室檢查，包括初診時外周血淋巴細胞絕對值計數、血紅蛋白(Hb)水平、血小板計數(PLT)，血清乳酸脫氫酶(LDH)、β2-微球蛋白(β2-MG)、CD38和ZAP70水平的相關性。結果 59例CLL初診患者中，存在1種及1種以上分子遺傳學異常的有49例，占83.1%。其中，del(13q) 34例(69.4%)，12號染色體三體(+12)和p53基因缺失各11例(22.4%)，ATM基因缺失5例(10.2%)。各分子遺傳學異常與患者臨床分期、外周血淋巴細胞計數絕對值、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表達水平之間均無明顯相關性(P>0.05)。≥60歲患者del(13q)異常率(67.6%)顯著高于<60歲患者(40.9%)，女性患者p53基因缺失的異常率(35.2%)顯著高于男性患者(11.9%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 FISH技術是檢測CLL患者分子遺傳學異常快速、準確、敏感的方法，分子遺傳學異常與患者初診時臨床表現之間無明顯相關性。

慢性淋巴細胞白血病； 熒光原位雜交； 分子遺傳學

慢性淋巴細胞白血病(CLL)是一種低度惡性的B淋巴細胞克隆性增殖疾病，預后個體差異很大，染色體異常是影響CLL預后和進展的重要因素，同時也是指導臨床治療的重要參考。但是由于CLL細胞有絲分裂指數低下，僅有20%左右的CLL患者能夠通過常規染色體顯帶技術(CC)檢測到克隆性染色體異常。間期熒光原位雜交(FISH)技術不受分裂象的限制，能夠通過特定探針特異性地檢測間期細胞的遺傳學異常，大大提高了其細胞遺傳學的異常檢出率。本研究應用FISH技術，采用5種探針檢測59例初診CLL患者常見的遺傳學異常，并結合患者初診時的臨床資料，探討各種遺傳學異常在臨床診斷和預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年12月福建醫科大學附屬協和醫院血液科收治的初診CLL患者59例，其中男42例，女17例，年齡33～85歲，中位年齡62歲，所有病例診斷標準參照《中國慢性淋巴細胞白血病診斷與治療專家共識》[1]。

1.2 儀器與試劑 固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)，2×枸櫞酸鹽(SSC)緩沖液，100%乙醇，85%乙醇，70%乙醇，北京金菩嘉公司的CSF12(12p11.1～12q11.1)、D13S25(13q14.3)、RB1(13q14)、ATM(11q22.3)及p53(17p13.1)5種探針(濃度為0.1%)，NP-40/2×SSC緩沖液，烤片機，水浴箱，Thermobrite雜交儀，OlympusBX51熒光顯微鏡。

1.4 統計學處理 采用SPSS18.0軟件包進行統計學處理，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1FISH檢測結果 59例CLL初診患者中，存在1種及1種以上分子遺傳學異常的有49例，占83.1%。檢出del(13q)34例，占69.4%(34/49)。del(13q)有3種模式，其中單純RB1基因(13q14)缺失1例，占2.9%(1/34)；單純D13S25(13q14.3)缺失11例，占32.4%(11/34)；以上二者共同缺失22例，占64.7%(22/34)。12號染色體三體(+12)和p53基因缺失均為11例，各占22.4%(11/49)。ATM基因缺失5例，占10.2%(5/49)。11例檢出2種及2種以上異常，占18.6%；均存在del(13q)。其中，del(13q)伴+12和del(13q)伴p53基因缺失者均有4例，各占36.4%(4/11)；del(13q)伴ATM基因缺失僅有1例，占9.1%(1/11)；有2例同時存在del(13q)、ATM缺失和P53缺失。

2.2 分子遺傳學異常與相關預后因素之間的關系 59例病例，根據Rai分期，0期16例，Ⅰ期18例，Ⅱ期13例，Ⅲ期4例，Ⅳ期8例；根據Binet分期，A期28例，B期19例，C期12例。患者性別、年齡、臨床分期、外周血淋巴細胞絕對值計數、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表達的不同分組中檢出的分子遺傳學異常率，見表1。各遺傳學異常與患者臨床分期、外周血淋巴細胞計數絕對值、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表達水平之間差異無統計學意義(P>0.05)；60歲以上患者del(13q)異常率(67.6%)顯著高于60歲以下患者(40.9%)，差異有統計學意義(P=0.03)；女性患者p53基因缺失的異常率(35.2%)顯著高于男性患者(11.9%)，差異有統計學意義(P=0.04)。

表1 不同臨床資料患者分子遺傳學的異常檢出率[n(%)]

續表1 不同臨床資料患者分子遺傳學的異常檢出率[n(%)]

注：與男性比較，*P<0.05；與≥60歲患者比較，#P<0.05。

3 討 論

CLL是西方國家成人最常見的一種白血病，但在我國發病率較低，它是一種低度惡性的小淋巴細胞克隆性疾病，多見于老年人。CLL患者的預后差異顯著，染色體異常是影響CLL預后和進展的一個重要因素；但是由于CLL細胞大多處于間期，增殖能力低下，北京大學血液病研究所的1項多中心研究表明，常規染色體顯帶技術僅有19.6%能夠檢測到克隆性染色體異常，且最常見的染色體異常為+12[2]。FISH技術利用堿基互補配對原則，用核酸探針來檢測染色體上相應堿基片段的改變，可以同時分析中期和間期細胞的染色體異常，且FISH技術具有更高的靈敏度，能夠檢測出常規核型分析所不能發現的DNA小片段(1～103kb)改變；因此，FISH檢測大大提高了CLL患者遺傳學異常的檢出率。

本研究中的59例患者中位年齡為62歲，男性患病率為女性的2.5倍，FISH檢測出的遺傳學異常率為83.1%，高于國內報道的63.3%～72.7%[3-4]， 與D?hner等[5]的報道相近。最常見的分子遺傳學異常為del(13q)，占所有異常的69.4%；其次為+12和p53基因缺失，各占22.4%；ATM缺失僅有5例，占10.2%。與Lai等[2]報道的del(13q)(56.4%)，+12(34.5%)，p53基因缺失(33.5%)和ATM缺失(30.5%)相比，除了del(13q14)檢出率較高以外，其余檢出率均較低，但高于Durak等[6]報道的del(11q22)5.1%的檢出率。

有研究表明，單純del(13q)的患者預后較好，其總體生存率甚至高于核型正常患者，但同時伴有+12、ATM缺失或P53缺失的患者預后較差[7]。D?hner等[5]的研究指出del(13q)的中位生存期(MS)為133個月，無治療生存期(TFS)可達92個月。但李文君等[8]發現RB1缺失陽性的患者Binet分期級別較高。本研究中23例RB1陽性患者Binet分期處于A期的有11例，B～C期的有12例，并無顯著差異。同時，本研究發現60歲以上患者del(13q)檢出率顯著高于60歲以下患者(P=0.03)。

+12是首先被發現的CLL常發的染色體異常，發生率為10%～35%[2]。有文獻報道，+12的患者常見于晚期，具有中等的預后及生存率[9]。但也有學者在用FISH評估+12對預后的影響時發現，患者是否存在+12與其生存期的長短并無相關性[5，10]。叢佳等[11]的研究發現+12遺傳學異常在>60歲年齡組中更易出現。本研究中11例檢出+12的患者中有7例為>60歲，但并未發現+12與年齡之間具有顯著相關性。

ATM基因位于11q22常見的缺失區，可能在細胞周期調控的DNA損傷修復中發揮作用，并與激活腫瘤抑制基因p53有關，伴有ATM基因缺失的CLL患者發病年齡一般在55歲以下，且病程常表現為侵襲性，有廣泛的外周、腹部、縱隔淋巴結腫大，疾病進展迅速，預后差[11]。本研究中，<60歲的患者ATM缺失率為13.6%，≥60歲的患者為5.4%，提示ATM缺失的年輕患者較多。李文君等[8]發現ATM缺失與患者血紅蛋白水平有顯著相關性，ATM缺失的患者更易出現全身廣泛淋巴結腫大，而全身淋巴結腫大和低血紅蛋白水平均導致預后不良。但本研究中的5例ATM缺失患者中，有4例處于Binet A期，且5例患者的Hb濃度均高于110 g/L，可能與樣本量較少或區域差異有關。

p53基因定位于17p13，是人體重要的抑癌基因。p53基因缺失是預后不良的重要指標，患者多處于疾病晚期[2]。El-Ghammaz等[12]指出17p-陽性患者多為65歲以上，Rai分期Ⅱ以上，并具有更高水平的LDH和β2-MG。而買買提力·依馬木等[13]的研究結果提示p53基因缺失與疾病后期及ZAP-70高表達有關。本研究發現女性患者p53基因缺失的異常率(35.2%)顯著高于男性患者(11.9%)，差異有統計學意義(P=0.04)；p53基因缺失的患者中，≥60歲和Rai分期Ⅱ以上的患者，均占45.5%(5/11)；但僅有1例患者ZAP70高表達。各項臨床指標與p53基因缺失的相關性有待于繼續擴大樣本量進行深入研究。

B細胞CD38或ZAP70表達與免疫球蛋白重鏈可變區(IgHV)突變情況有一定相關性，CD38或ZAP70陽性患者預后差[1]。因此，CD38或ZAP70常被作為有價值的CLL預后指標。本研究中檢出7例CD38或ZAP70高表達患者，其中2例處于Binet A期，均為單純del(13q)；5例處于Binet B～C期，其中2例p53基因缺失，1例+12，1例del(13q)伴+12。但未發現CD38或ZAP70表達與臨床分期及各種遺傳學異常間的相關性。研究中還發現1例RB1、D13S25、ATM、+12和p53均擴增的患者，Binet分期A期，其臨床表現及預后還有待于進一步隨訪觀察。

本研究發現各遺傳學異常與患者臨床分期、外周血淋巴細胞絕對值計數、Hb、PLT、LDH、β2-MG、CD38和ZAP70表達水平之間無明顯相關性；≥60歲患者del(13q)檢出率顯著高于<60歲患者；女性患者p53基因缺失的檢出率顯著高于男性患者。將來，本實驗室將通過擴大樣本量及對患者預后做長期隨訪觀察以深入探討遺傳學異常與CLL預后的相關性。

[1]李建勇,邱錄貴.中國慢性淋巴細胞白血病診斷與治療專家共識[J].中華血液學雜志,2010，31(2):141-144.

[2]Lai YY,Huang XJ.Cytogenetic characteristics of B cell chronic lymphocytic leukemia in 275 Chinese patients by fluorescence in situ hybridization:a multicenter study[J].Chin Med J(Engl),2011，124(16):2417-2422.

[3]戴丹,張秀群,張學忠，等.30例慢性淋巴細胞白血病分子遺傳學異常的FISH檢測的意義[J].中國實驗血液學雜志,2009，17(1):31-35.

[4]Qiu HX,Xu W,Cao XS,et al.Cytogenetic characterisation in Chinese patients with chronic lymphocytic leukemia:a prospective,multicenter study on 143 cases analysed with interphase fluorescence in situ hybridization[J].Leuk Lymphoma,2008，49(10):1887-1892.

[5]D?hner H,Stilgenbauer S,Benner A,et al.Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia[J].N Engl J Med,2000，343(26):1910-1916.

[6]Durak B,Akay OM,Aslan V,et al.Prognostic impact of chromosome alterations detected by FISH in Turkish patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Genet Cytoqenet,2009，188(2):65-69.

[7]Saqatys EM,Zhang L.Clinical and laboratory prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia[J].Cancer Control,2012,19(1):18-25.

[8]李文君,郭力,侯明,等.慢性淋巴細胞白血病間期熒光原位雜交檢測染色體異常及臨床分析[J].中國實驗血液學雜志,2010,18(2):494-498.

[9]Zenz T,D?hner H,Stilqenbauer S.Genetics and risk-stratified approach to therapy in chronic lymphocytic leukemia[J].Best Pract Res Clin Haematol,2007,20(3):439-453.

[10]曹鵬飛,陳蘇華,張國平,等.熒光原位雜交技術檢測慢性淋巴細胞白血病細胞遺傳學的異常[J].臨床血液學雜志,2014,27(3):240-243.

[11]叢佳,李輝,周道斌,等.84例慢性淋巴細胞白血病遺傳學異常及預后分析[J].基礎醫學與臨床,2012,32(1):1-6.

[12]El-Ghammaz AM,Abdelwahed E,Mostafa NN,et al.De novo deletion 17p13.1 as a predictor for disease progression in chronic lymphocytic leukemia[J].Clin Exp Med,2014:317-318.

[13]買買提力·依馬木,古再麗努爾·吾甫爾,王曉敏,等.熒光原位雜交技術檢測新疆慢性淋巴細胞白血病患者p53基因缺失及其臨床意義[J].中華醫學遺傳學雜志,2014,31(4):499-503.

Fluorescence in situ hybridization detection of molecular cytogenetic aberrations in 59 patients with chronic lymphocytic leukemia*

FUQiang，LINXiao-lan，CHENWan-zi，CHENJia-di，HUANGHui-fang△

(FujianInstituteofHematology/FujianProvincialKeyLaboratoryonHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital,Fuzhou,Fujian350001,China)

Objective To investigate the significance of interphase fluorescence in situ hybridization(FISH) technology for detecting common molecular cytogenetic abnormalities in the patients with chronic lymphocytic leukemia(CLL).Methods The bone marrow cells from 59 patients with newly diagnosed CLL were performed the interphase FISH detection by 5 probes,including CSF12(12p11.1-12q11.1),D13S25(13q14.3),RB1(13q14),ATM(11q22.3) and p53(17p13.1).Then the correlation between the molecular cytogenetic abnormalities and the clinical Binet staging,Rai staging and the related laboratory examinations including peripheral blood lymphocyte absolute count,Hb,PLT,LDH,β2-MG,ZAP70 and CD38 levels were analyzed.Results Among 59 cases of newly diagnosed CLL,49 cases(83.1%) had one and more than one kind of molecular cytogenetic aberrations,in which del(13q) was 34 cases(69.4%),each of +12 and del(p53) was 11 cases(22.4%) and del(ATM) was 5 cases(10.2%).The molecular cytogenetic abnormalities had no obvious correlation with the Binet staging,Rai staging,peripheral lymphocyte absolute count,Hb,PLT,serum levels of LDH,β2-MG,ZAP70 and CD38(P>0.05).The abnormality rate of del(13q) in the over 60 years old group was significantly higher than that in the less than 60 years old group(P=0.03),and the abnormality rate of p53 deletion in female was higher than that in male,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionTheFISHtechnologyisarapid,accurateandsensitivemethodindetectingmolecularcytogeneticabnormalitiesinCLLpatients,andthereisnosignificantcorrelationbetweenmolecularcytogeneticabnormalitiesandclinicalmanifestationsinfirstvisitinghospital.

chroniclymphocyticleukemia；FISH；moleculargenetics

國家臨床重點專科建設項目(財社[2011]170號)；福建省臨床重點專科建設項目(閩衛科教[2012]149號)。

傅薔，女，本科，檢驗技師，主要從事臨床檢驗研究。△

，E-mail：huanghuif@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.009

A

1672-9455(2015)20-2991-03

2015-01-29

2015-04-17)