基于雙啟動寡聚核苷酸引物的沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌多重實時熒光PCR方法的建立*

梁 紅，李 明，賈 昕，許軍強

(華美生物工程有限公司，河南洛陽 471003)

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·論 著·

基于雙啟動寡聚核苷酸引物的沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌多重實時熒光PCR方法的建立*

梁 紅，李 明，賈 昕，許軍強

(華美生物工程有限公司，河南洛陽 471003)

目的 建立多重實時熒光PCR同時檢測沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌的方法。方法 通過設計針對沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌和耶爾森菌的雙寡聚核苷酸引物，來建立這4種病原體的多重PCR檢測體系。結果 建立的多重PCR體系可同時特異性擴增4種病原體的DNA片段。沙門菌和彎曲桿菌的特異性和敏感度都是100.0%，志賀菌和耶爾森菌的敏感度是100.0%，特異性分別是99.3%和98.6%。最低檢測限均為103copies/mL。結論 該體系可快速、有效、準確檢測出樣品中4種病原體的存在，可用于腸胃道相關病原體感染的輔助評價。

多重實時熒光PCR； 沙門菌； 志賀菌； 彎曲桿菌； 耶爾森菌

沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌是感染性腹瀉的常見致病菌，可導致細菌性痢疾、食物中毒、傷寒等腸道傳染病[1-2]。在我國，70%～80%細菌性食物中毒是由沙門菌引起的[3]。志賀菌是細菌性痢疾的主要病原體，人群普遍易感，全球每年約有100萬人死于此病，在我國的發病率一直處于較高水平，尤其以嬰兒和兒童更為易感[4-5]。彎曲桿菌廣泛分布于自然界，可通過食物、水傳播，其感染率近些年來在世界各地呈普遍上升趨勢，在一些發達國家，彎曲桿菌感染引起的腹瀉甚至超過了沙門菌和志賀菌，成為最常見的腹瀉致病菌[6]。耶爾森菌是人獸共患性細菌，也是一種危害嚴重的食源性致病菌，在發達國家和發展中國家都有非常高的流行性。因此，建立快速、經濟、靈敏、特異的檢測方法對于疾病的防治具有十分重要的意義。

多重PCR技術是在常規PCR技術的基礎上發展的新型技術，可在同一體系同時擴增多個病原體核酸片段。目前國內外對病原體的研究已廣泛采用多重PCR方法[7-9]，相較于常規的培養法、血清學方法，它更加方便、靈敏、省時，但國內研究中并未見這4種病原體同時檢測的報道。本研究建立同時檢測沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌的多重PCR方法，采用實時熒光TaqMan探針和雙啟動寡聚核苷酸(DPO)技術，有效提高擴增的特異性和擴增效率，結果判斷實時、安全，達到快速準確同時檢測沙門菌、志賀菌、彎曲桿菌、耶爾森菌的目的，對于胃腸道菌群的鑒別檢測具有很好的實用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌、小腸結腸炎耶爾森菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌來自美國典型菌種保存中心(ATCC)。

1.2 標本來源 145份臨床標本來源于鄭州大學第一附屬醫院和河南科技大學第一附屬醫院。

1.3 儀器與試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒購自Qiagen公司(QIAamp DNA Stool Kit)；分子生物學試劑、Taq DNA聚合酶、dNTP由華美生物工程有限公司提供；引物、探針由上海Invitrogen公司合成；PCR產物純化試劑盒和T-A克隆試劑盒購自大連Takara公司；培養基購自英國Oxoid公司。ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國Lifetechnology公司。

1.4 方法

1.4.1 DPO引物和Taqman探針的設計 本體系中需同時檢測4段目的基因，若采用普通引物，引物間極易形成二聚體，特異性低，且體系不易調配至適合所有目的基因的擴增。故本體系將采用退火溫度范圍寬且特異性強的DPO引物。檢索GenBank中相關基因序列，做同源性對比后，最終選擇在以下基因中選擇各病原體的靶序列，見表1。并根據Chun等[9]來設計DPO引物，先確定短3′端，長度為6～15 bp，GC水平為40%～80%，反向延伸18～25 bp為其5′端，Tm>65 ℃。在其中序列設計出相應的Taqman探針，并以不同熒光標記區分，序列見表2。

表1 各病原體引物的靶基因

表2 DPO引物和探針設計結果

1.4.2 質粒標準品的構建 將已知陽性目的菌培養物用細菌DNA提取試劑提取DNA，并以其為模板進行常規PCR擴增，產物用PCR產物純化試劑盒和T-A克隆試劑盒分別回收目的擴增片段，并將其克隆入pMD19-T載體中，轉化于大腸桿菌JM109感受態細胞中，培養后收集菌體，堿變性法提取質粒，然后由上海Invitrogen公司測序。

1.4.3 樣本的制備 培養物：將培養物轉移至生理鹽水中，5 000 r/mim離心10 min，棄上清液后溶解于200 μL生理鹽水中，按DNA提取試劑盒說明書步驟提取DNA。臨床標本：收集的糞便標本置-20 ℃保存待用。處理及DNA提取均按核酸提取試劑盒說明書步驟進行。收集洗脫體積為50 μL，10 μL用于PCR擴增。

1.4.4 PCR擴增體系設定 PCR擴增試劑采用一步法預混試劑，反應體系共25 μL，包括：2×PCR Buffer 12.5 μL(20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3，100 mmol/L KCl,6 mmol/L MgCl2,0.002%明膠，400 μmol/L dNTPs)，5 μmol/L各引物探針混合物 1.5 μL，2 U Taq DNA聚合酶1.0 μL，待測樣品10 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，40個循環步驟包括95 ℃變性8 s，60 ℃退火和延伸34 s。

1.4.5 結果判定 反應結束后，根據熒光圖譜確定各目的基因的基線和閾值，所有陰性對照曲線低于閾值線，樣本擴增曲線與閾值線的交叉值記錄樣本的Ct值，若反應曲線呈對數增長，而且Ct<33，則表明為陽性，否則判為陰性。

2 結 果

2.1 特異性

2.1.1 引物和探針 引物與探針經過BLAST檢索，具有針對病原體唯一性。

2.1.2 培養物檢測 (1)將腸道正常菌群(乳酸桿菌、雙歧桿菌)培養物(4種目標菌陰性)進行特異性評價，用本體系引物探針分析，均無熒光擴增信號(圖1)。顯示特異性良好。(2)分別采用已知沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌或小腸結腸炎耶爾森菌陽性的培養物材料進行分析，擴增顯示單一條帶，所有陽性結果符合(圖2)。(3)將4種菌培養產物隨機2種、3種等量混合，取樣品抽提DNA后，用本體系引物探針分析，所有陽性、陰性符合(圖3、4)。(4)將4種菌培養產物等量混合，取樣品抽提DNA后，用本體系引物探針分析，所有陽性符合，顯示4條熒光擴增信號，且曲線形態標準、平滑(圖5)。

圖1 陰性樣本檢測熒光圖譜表3 質粒最低檢出量(Ct)

病原體106copies/mL105copies/mL104copies/mL103copies/mL沙門菌22.4625.7429.1832.20志賀菌22.6925.9429.3132.53彎曲桿菌22.6725.4728.8232.46耶爾森菌23.0125.7928.8733.05

圖2 彎曲桿菌樣本檢測熒光圖譜

圖3 彎曲桿菌和沙門菌混合樣本檢測熒光圖譜

圖4 沙門菌、志賀菌、耶爾森菌混合樣本檢測熒光圖譜

圖5 4種病原體混合樣品檢測熒光圖譜

2.2 靈敏度 最低檢出量采用已知濃度質粒DNA進行梯度稀釋(102～109copies/mL)來確定，檢測最低4個稀釋度重復10次，最低檢出量均為103copies/mL，見表3。

2.3 標準曲線 多重PCR體系檢測標準品質粒稀釋度線性范圍103～106copies/mL。r2>0.97,重復性好，各項參數均在偏差范圍內。各質粒標準曲線參數見表4。

2.4 臨床標本檢測 145份臨床標本分別用培養法和多重實時熒光PCR法進行檢測，沙門菌和彎曲桿菌的特異性和敏感度都是100.0%，志賀菌和耶爾森菌的敏感度是100.0%，特異性分別是99.3%和98.6%。

表4 各病原體質粒標準曲線參數

3 討 論

細菌性腸胃炎是臨床最常見的疾病，每年夏、秋季是其發作的高峰期，由于溫度、濕度大，食物易腐敗、變質，導致細菌極易欺辱腸胃，臨床表現多為惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發熱等。臨床鑒別是哪種細菌感染需做細菌培養、生化檢測、血清鑒定等，至少需24 h才能得到結果。而多重實時熒光PCR可實現一管多檢，可縮短檢測時間至3 h，大大提高了檢測效率。但多重PCR體系中難以克服的問題是，多引物間會形成二聚體，與單重PCR相比，引物與模板的錯配概率大大增加。雙啟動寡核苷酸技術是將PCR引物分為兩段獨立的特異性區域，中間由寡聚次黃嘌呤堿基進行橋接，增強了引物間的兼容性，減少非特異性，能有效地提高PCR反應的敏感度與特異性，還可極大提高擴增效率[10]。

本研究所建立的多重實時熒光PCR體系，4種細菌質粒的最低檢測限為103copies/mL；擴增效率為99%～110%；回歸系數接近1.00；相較于同類方法文獻[11-12]數據一致，結果可靠。特定細菌組合檢測未有非特異性結果產生；經臨床標本驗證，與金標準培養法相比，沙門菌和彎曲桿菌檢測的特異性都為100.0%，志賀菌為99.3%，耶爾森菌為98.6%，陽性檢出率高于培養法，靈敏度為100.0%。該方法的優勢在于它不同于常規PCR擴增，不需要進行反應后凝膠電泳分析，在反應進行中即可通過特定標記熒光值實時監測反應情況，可避免開管檢測，有效降低污染風險；同時敏感度高、特異性好、檢測耗時短的特點，使得操作更加簡便、直觀、安全、可靠。該方法的應用將有助于臨床上快速鑒別特定細菌感染，進行針對性防治，使得其臨床應用前景十分廣闊，為多重實時熒光PCR方法在細菌性腸胃炎檢測的商品化奠定了良好的基礎。

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Establishment of multiplex real-time fluorescence PCR for Salmonella,Shigella,Campylobacter and Yersinia enterocolitica basing on dual priming oligonucleotide system*

LIANGHong,LIMing,JIAXin,XUJun-qiang

(Sino-AmericanBiotechnologyCo.,Ltd.，Luoyang，He′nan471003，China)

Objective To establish a multiplex real-time fluorescence PCR assay for simultaneously detecting Salmonella,Shigella,Campylobacter and Yersinia enterocolitica.Methods Dual priming oligonucleotide(DPO) was designed for these four pathogens.A multiplex RT-PCR assay system was developed using DPO primers.Results The specific DNA fragments of 4 kinds of pathogen were amplified simultaneously and specifically by this established PCR assay system.The specificity and sensitivity of the assay for detecting Salmonella and Campylobacter all were 100.0%,the sensitivities for detecting Shigella and Yersinia enterocolitica were 100.0% and the specificities were 99.3% and 98.6% respectively.The limit of detection(LOD) was 103copies/mL.Conclusion This multiplex RT-PCR system can detect the existence of these four kinds of pathogen rapidly,effectively and accurately and can be used the auxiliary evaluation of gastrointestinal related pathogen infection.

multiplex real-time PCR; Salmonella; Shigella; Campylobacter; Yersinia enterocolitica

河南省洛陽市科技發展計劃項目(1301068A)。

梁紅，女，本科，高級工程師，主要從事分子診斷研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.011

A

1672-9455(2015)20-2997-03

2015-02-15

2015-05-05)