重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義*

汪 勤，趙春輝，夏良萍，朱華英

(1.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院ICU，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇省鎮(zhèn)江市精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；3.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；4.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

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·論 著·

重度子癇前期患者外周血Th17和Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義*

汪 勤1，趙春輝2△，夏良萍3，朱華英4

(1.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院ICU，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇省鎮(zhèn)江市精神衛(wèi)生中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；3.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001；4.江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 探討重度子癇前期(sPE)患者外周血Th17及CD4+CD25+Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-21、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的水平變化及意義。方法 選取30例sPE患者(sPE組)及30例正常妊娠者(對照組)作為研究對象。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中Th17及CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平。采用QRT-PCR檢測維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)mRNA和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。采用ELISA法檢測血漿IL-17、IL-21、IL-10和TGF-β水平。結(jié)果 sPE組外周血Th17細(xì)胞水平為(1.16±0.78)%，顯著高于對照組的(0.68±0.35)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.447，P=0.002)。sPE組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平為(1.65±0.49)%，顯著低于對照組的(2.42±0.91)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.25，P=0.000)。sPE組RORγt mRNA表達(dá)水平為0.190±0.063，高于對照組的0.136±0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.776，P=0.001)。而sPE組Foxp3 mRNA表達(dá)水平為0.069±0.025，低于對照組的0.127±0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.218，P=0.000)。sPE組IL-17、IL-21、IL-10水平分別為(82.03±37.61)、(63.29±27.42)、(56.89±17.28)ng/L，高于對照組的(30.81±21.87)、(33.87±13.73)、(33.24±11.93)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TGF-β水平為(24.34±6.51)ng/L，低于對照組的(46.97±15.81)ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.781，P=0.000)。sPE患者血漿IL-17、IL-21水平與Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r分別為0.695、0.586，P<0.01)。結(jié)論 sPE患者Th17細(xì)胞數(shù)量升高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量減少，以及相關(guān)細(xì)胞因子的紊亂在sPE的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。

先兆子癇； T淋巴細(xì)胞； 細(xì)胞因子類

重度子癇前期(sPE)是危害嚴(yán)重的妊娠期特有疾病，常伴有嚴(yán)重的母嬰并發(fā)癥，導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局。隨著對Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的深入研究，對sPE的病因及發(fā)病機(jī)制有了更深的認(rèn)識(shí)。Th17和Treg細(xì)胞是近年新發(fā)現(xiàn)的2個(gè)不同于Th1和Th2的Th細(xì)胞亞群。Th17細(xì)胞可產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-17等細(xì)胞因子，與促炎反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥等密切相關(guān)。因此Th17細(xì)胞可能會(huì)由于這種促炎作用而在胚胎免疫排斥的發(fā)生中起一定作用[1]。而Treg細(xì)胞是可誘導(dǎo)免疫耐受并且有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，有助于母體對胎兒耐受[2]。本研究通過測定sPE患者外周血中Th17、CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，探討其在sPE發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月至2013年12月在鎮(zhèn)江市婦幼保健院行剖宮產(chǎn)分娩的30例sPE患者為研究對象(sPE組)。由于sPE的病因和臨床表現(xiàn)有明顯的異質(zhì)性，為了減少這種異質(zhì)性及孕周對檢測結(jié)果的影響，本研究選擇妊娠32～40周且符合sPE診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例，未包括合并HELLP綜合征、腎功能不良及胎兒生長受限的病例。另選擇血壓正常，無糖尿病、腎炎、肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、孕周匹配的30例剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦作為對照組。兩組行均衡性檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組產(chǎn)婦的臨床一般資料見表1。sPE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版。

表1 受試者的臨床資料

組別丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L)尿素氮(mmol/L)血小板計(jì)數(shù)(×109/L)新生兒體質(zhì)量(g)胎盤質(zhì)量(g)sPE組23.4±8.53.7±1.3150.4±43.82951.8±235.2487.3±58.4對照組24.2±7.83.5±0.8161.8±35.23368.2±232.5542.5±65.9

注：與對照組比較，*P<0.05。

1.2 儀器與試劑 Biolegend公司人Th17流式檢測試劑盒：包括FITC標(biāo)記的抗人CD3，PE標(biāo)記的抗人CD4，AlexaFluor647標(biāo)記的抗人IL-17及相匹配的鼠IgG1同型對照，固定液和破膜洗液。Biolegend公司CD4+CD25+Foxp3+Treg一步法流式檢測試劑盒：包括PerCP標(biāo)記的抗人CD4，PE標(biāo)記的抗人CD25，AlexaFluor488標(biāo)記的FOXP3及相匹配的鼠IgG1同型對照，F(xiàn)OXP3固定/破膜液和破膜緩沖液；佛波酯、離子霉素均購自Sigma公司；莫能霉素購自Biolegend公司；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型號(hào)及FACSDiva軟件，美國BD公司)。mRNA檢測：Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，qRT-PCR試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品；日立U00800型紫外分光光度儀(日立，日本)；Bio-RadMyIQ PCR儀(Bio-Rad，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(Alpha，美國)；電泳儀(Bio-Rad，美國)。細(xì)胞因子檢測：ELISA試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品；Bio-Rad imark酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集兩組產(chǎn)婦外周血6 mL，肝素抗凝。其中2 mL用于流式細(xì)胞術(shù)檢測分析，2 mL用于檢測維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)和Foxp3的mRNA表達(dá)水平，2 mL用于細(xì)胞因子檢測。

1.3.2 Th17細(xì)胞的檢測 用Ficoll密度梯度法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸提取的PBMC；取20 μL細(xì)胞懸液加20 μL錐蟲藍(lán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106/mL；加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，終濃度為100 ng/mL)和離子霉素(終濃度為1 μg/mL)并充分混勻，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后加入莫能霉素(終濃度1 μL/mL)混勻后繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取刺激培養(yǎng)后細(xì)胞懸液100 μL于流式管中，每管加0.5 mL固定液，振蕩搖勻后室溫孵育20 min；加2 mL破膜洗液，振蕩搖勻后室溫孵育20 min，離心后棄上清液；破膜洗液洗滌和重懸細(xì)胞，加入10 μL抗人IL-17Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE抗體混勻后室溫暗處孵育30 min；陰性對照管則加入抗人IL-7同型對照鼠IgG1/CD3 F1TC/CD4 PE；0.5 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的檢測 用PBS重懸提取的PBMC；取20 μL細(xì)胞懸液加20 μL錐蟲藍(lán)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107/mL；加入1 mL FOXP3固定/透膜液，充分混勻后室溫孵育20 min；洗滌液及1 mL FOXP3透膜緩沖液重懸細(xì)胞，暗處孵育15 min；加入10 μL抗人FOXP3 Alexa Fluor488/CD25PE/CD4 PerCP抗體混勻后暗處孵育30 min；0.5 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4 RORγt和Foxp3 mRNA的檢測 用Trizol試劑一步法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，于-20 ℃保存。引物序列設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[3]。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表2)。反應(yīng)體系(總體積25 μL)：SYBRGreen MIX 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL，dNTP 1.6 μL;分別加入上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL;MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL。RORγt PCR條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。Foxp3 PCR條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算RORγt和Foxp3 mRNA的相對表達(dá)量。

表2 引物序列及目的基因擴(kuò)增范圍

注：F為上游引物，R為下游引物。

1.3.5 血漿IL-17、IL-21、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)檢測 采用ELISA法檢測血漿IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

2 結(jié) 果

2.1 Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平 sPE患者外周血Th17細(xì)胞水平為(1.16±0.78)%，高于健康對照組的(0.68±0.53)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.45，P=0.002)；sPE患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平為(1.65±0.49)%，低于健康對照組的(2.42±0.91)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.25，P=0.000)。

2.2 RORγt和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平 sPE患者外周血RORγt mRNA表達(dá)水平為0.19±0.06，高于健康對照組的0.14±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.78，P=0.001)；sPE患者外周血Foxp3 mRNA表達(dá)水平為0.07±0.03，低于健康對照組的0.13±0.03,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.22，P=0.000)。

2.3 細(xì)胞因子檢測結(jié)果 sPE患者外周血IL-17、IL-21、IL-10明顯高于健康對照組，TGF-β水平明顯低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 重度子癇患者血漿中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平

2.4 相關(guān)性分析 sPE患者血漿IL-17、IL-21水平與Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r分別為0.695、0.586，P<0.01)；RORγt mRNA表達(dá)水平與Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.739，P<0.01)；Foxp3 mRNA的表達(dá)水平與CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.689，P<0.01)；IL-10、TGF-β與Th17和CD4+CD25+Treg細(xì)胞無相關(guān)性。

3 討 論

3.1 sPE患者外周血Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子變化及意義 Th17細(xì)胞分泌高水平的IL-17、IL-21、IL-23，并高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt[4]。Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病中的研究證實(shí)其參與人體內(nèi)免疫及炎性反應(yīng)的生物學(xué)過程，但其在妊娠及其并發(fā)癥中的研究較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IL-17等Th17細(xì)胞系列細(xì)胞因子與造成胎膜早破、宮內(nèi)感染有密切關(guān)系[5]。Bewster等[6]研究表明，sPE患者血漿中IL-17水平與對照組相比顯著增高。本研究發(fā)現(xiàn)，sPE患者外周血Th17細(xì)胞高于對照組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)sPE患者外周血Th17細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子IL-17、IL-21及Th17細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子RORγt也顯著增高。進(jìn)一步證明Th17細(xì)胞在sPE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。在胎盤形成的過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵蝕子宮內(nèi)膜蛻膜和淺肌層，螺旋動(dòng)脈發(fā)生重鑄，從而維持胎盤有足夠的血流量。正常妊娠時(shí)，母體免疫系統(tǒng)低水平激活，類似于輕度的炎性反應(yīng)。高水平IL-17可與多種因子協(xié)同發(fā)揮作用以放大胎盤小血管炎性反應(yīng)，同時(shí)IL-17有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞的能力，通過釋放活性物質(zhì)后損害內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生氧自由基是構(gòu)成了sPE血管痙攣、血壓升高、水腫、蛋白尿等臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)[7]。從而發(fā)生胎盤組織凋亡、著床變淺、螺旋小動(dòng)脈管腔狹窄等形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。

3.2 sPE患者外周血Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子變化及意義 Treg細(xì)胞以表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制基因Foxp3為特征并分泌IL-10、TGF-β，是一個(gè)可誘導(dǎo)免疫耐受并具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群[8]。近年來有研究證實(shí)，sPE患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量與對照組相比明顯減少[9]。本研究將CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3 mRNA結(jié)合起來研究其在sPE中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)sPE患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3 mRNA的表達(dá)量顯著低于對照組。提示sPE發(fā)生與Treg細(xì)胞的免疫抑制功能減弱有關(guān)。Treg細(xì)胞是維持肌體自身免疫耐受的重要組成部分，Treg細(xì)胞活化后能抑制自身反應(yīng)性活化、增殖、分化，參與正常妊娠的免疫平衡。Treg細(xì)胞在胚胎著床及妊娠維持過程中起著至關(guān)重要的作用[10]。Treg細(xì)胞數(shù)量的減少伴隨母體對胎兒排斥反應(yīng)的發(fā)生。而Foxp3是Treg細(xì)胞生長發(fā)育和發(fā)揮功能的主要調(diào)節(jié)基因[11]，F(xiàn)oxp3表達(dá)下降可能是影響Treg細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞減少的因素之一，直接導(dǎo)致Treg細(xì)胞和效應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞之間的不平衡，引發(fā)病理妊娠。本研究結(jié)果表明,PE組外周血中Foxp3的表達(dá)明顯減低,提示子癇前期的發(fā)生與Treg細(xì)胞的免疫抑制功能減弱有關(guān)。Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分化是密切相關(guān)的，細(xì)胞因子TGF-β在T淋巴細(xì)胞中起雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度的TGF-β在促炎細(xì)胞因子的環(huán)境中誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)水平下降，而RORγt表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化；而高濃度TGF-β能抑制IL-17的表達(dá)，增加Foxp3表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)sPE患者TGF-β水平明顯降低，推測TGF-β的降低導(dǎo)致Treg細(xì)胞減少，Th17細(xì)胞增加，使sPE患者免疫抑制作用減弱，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。雖然CD4+CD25+Treg能分泌IL-10，但是本研究中，sPE患者IL-10水平明顯高于對照組，這與Treg細(xì)胞減少不相符，提示IL-10可能源于其他T細(xì)胞。

綜上所述，CD4+T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在母胎免疫識(shí)別和耐受過程中發(fā)揮重要的作用。隨著新的CD4+T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)將傳統(tǒng)的妊娠免疫理論Th1/Th2模式發(fā)展為Th1/Th2/Treg/Th17模式[13]。妊娠可看做是一種成功的同種半異體移植過程，妊娠是否成功有賴于胎兒與母體間的免疫平衡。Th17、Treg細(xì)胞通過與其分泌的細(xì)胞因子間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，精細(xì)調(diào)節(jié)母胎的免疫平衡。這種平衡一旦失調(diào)，即可引發(fā)排斥反應(yīng)，導(dǎo)致妊娠失敗或病理妊娠。研究Th17、Treg細(xì)胞在sPE發(fā)病機(jī)制中的作用為臨床預(yù)測和治療該疾病提供了一個(gè)新的思路，可能通過阻斷或增強(qiáng)其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)，尋找到治療sPE等妊娠合并癥的新靶點(diǎn)。

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Expression and significance of peripheral blood Th17,Treg cells and related cytokines in patients with severe preeclampsia*

WANGQin1,ZHAOChun-hui2△,XIALiang-ping3，ZHUHua-ying4

(1.ICU,FourthAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China；2.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhenjiangMunicipalMentalHealthCenter,Zhenjiang,Jiangsu212001,China；3.DepartmentofClinicalLaboratory,FourthAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China；4.DepartmentofObstetrics,FourthAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To investigate the changes and signifcance of peripheral blood Th17,CD4+CD25+iTreg cells and the related cytokines (IL-17,IL-21,IL-10 ) and TGF-βin the patients with severe preeclampsia(sPE).Methods 30 sPE patients(sPE group) and 30 cases of normal pregnancy(control group) were selected as the research subjects.The levels of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were detected by flow cytometry.QRT-PCR was used to detect the mRNA expression level of RORγt and Foxp3.Plasma cytokines levels of IL-17,IL-21,IL-10 and TGF-β were measured by ELISA.Results The peripheral blood Th17 cells level in the sPE group was signifcantly higher than that in the control group,the difference was statistically significant[(1.16±0.78)%vs. (0.68±0.35)%,t=3.447,P=0.002].The level of peripheral blood CD4+CD25+Treg cells in the sPE group was lower than that in the control group,the difference was statistically significant[(1.65±0.49)%vs. (2.42±0.91)%,t=-4.25，P=0.000].The expressions level of RORγt mRNA in the sPE group was higher than that in the control group,the difference was statistically significant[(0.190±0.063)vs. (0.136±0.037),t=3.776，P=0.001],but the expression level of Foxp3 mRNA was decreased compared with the control group,the difference was statistically significant[(0.069±0.025)vs. (0.127±0.027),t=-8.218，P=0.000].Plasma levels of IL-17,IL-21 and IL-10 in the sPE group were (82.03±37.61),(63.29±27.42),(56.89±17.28)ng/L respectively,which were higher than(30.81±21.87),(33.87±13.73),(33.24±11.93) ng/L in the control group respectively,the differences were statistically significant(P<0.01).However,the TGF-β level in the sPE group was markedly decreased compared with the control group,the difference was statistically significant[(24.34±6.51)ng/Lvs. (46.97±15.81)ng/L,t=-7.781，P=0.000].Plasma IL-17 and IL-21 levels in the sPE patients were positively correlated with the Th17 cells level(r=0.695,0.586,P<0.01).Conclusion Th17 cells increase,CD4+CD25+Treg cells decrease and related cytokines disorder in the sPE patients could play an important role in the pathogenesis of sPE.

preeclampsia； T-lymphocytes; cytokines

江蘇省鎮(zhèn)江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SH2013061、SH2014063)。

汪勤，女，本科，副主任醫(yī)師，主要從事危重病急救工作。△

，E-mail:jyk252@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.027

A

1672-9455(2015)20-3040-04

2015-03-20

2015-07-10)