不同保存時間對血漿標本中人巨細胞病毒載量的影響

張 玲，張清祿

(陜西省渭南市中心醫(yī)院檢驗科 714000)

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·論 著·

不同保存時間對血漿標本中人巨細胞病毒載量的影響

張 玲，張清祿

(陜西省渭南市中心醫(yī)院檢驗科 714000)

目的 研究4 ℃條件下存放30 d后血漿中人巨細胞病毒DNA的穩(wěn)定性。方法 選擇進行造血干細胞移植的150例患者的血漿標本，將其按照人巨細胞病毒DNA載量分為3組：低載量組(n=50,人巨細胞病毒DNA載量為300～1 000 copy/mL)、中載量組(n=50，人巨細胞病毒DNA載量為>1 000～10 000 copy/mL)和高載量組(n=50，人巨細胞病毒DNA載量為>10 000～100 000 copy/mL)。標本采集后2 h內(nèi)完成基線載量(0 d)檢測，其余血漿在4 ℃條件下保存，分別在保存1、2、3、7、14、21、30 d時檢測人巨細胞病毒載量。結果 低、中、高載量組標本在保存1、2、3、7、14、21、30 d后，其人巨細胞病毒載量與0 d結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 血漿標本在4 ℃條件下存放30 d對人巨細胞病毒載量檢測結果無影響。

保存時間； 血漿； 標本； 人巨細胞病毒

人巨細胞病毒實質(zhì)是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，是皰疹病毒科β屬。人巨細胞由220～245 kb的基因組成，直徑約200 nm[1]。它是人類先天性病毒感染的主要病原體，在人群中的感染率極高，是器官移植、艾滋病患者等免疫力低下人群常見的感染和死亡原因[2-6]。由于患者發(fā)生人巨細胞病毒感染后無明顯臨床癥狀，或者其所致的疾病癥狀沒有特異性，因此人巨細胞病毒感染必須依靠實驗室診斷。目前臨床上常用的人巨細胞診斷方法為病毒抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測和特異性抗體檢測[7-8]。實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測可以及時反映人巨細胞病毒的活動狀態(tài)，所以使用范圍最廣。目前，專家對不同標本保存溫度和保存時間對人巨細胞病毒DNA穩(wěn)定性的影響意見不一[9-10]。本研究選取2013年9月至2014年9月在本院進行造血干細胞移植的150例患者的血漿標本，研究4 ℃條件下保存30 d后血漿中人巨細胞病毒DNA 的穩(wěn)定性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年9月至2014年9月在本院進行造血干細胞移植的150例患者的血漿標本。150例患者中，急性淋巴細胞性白血病38例，急性髓系細胞白血病40例，慢性粒細胞白血病34例，多發(fā)性骨髓瘤11例，骨髓增生異常綜合征10例，非霍奇金淋巴瘤8例，其他血液病9例；男性86例，女性64例，年齡3～50歲，平均(22.38±2.57)歲。

1.2 分組方法 將所獲血漿標本按照人巨細胞病毒的DNA載量分為3組：低載量組(300～1 000 copy/mL)，327～948 copy/mL,平均714 copy/mL，共50份標本；中載量組(>1 000～10 000 copy/mL)，1 027～8 927 copy/mL，平均4 873 copy/mL，共50份標本；高載量組(>10 000～100 000 copy/mL)，23 802～92 749 copy/mL，平均57 426 copy/mL，共50份標本。

1.3 RT-PCR 將采集的血液標本分別進行編號，放置于含EDTA的抗凝管(江西精致科技有限公司提供)中，立即送檢，700×g離心10 min，離心后取1 mL無溶血的血漿標本進行RT-PCR檢測，其余血漿標本置于4 ℃保存，分別在保存1、2、3、4、7、14、21、30 d時進行RT-PCR檢測，每次檢測前都要進行離心去除雜質(zhì)。使用人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司提供)進行核酸提取及RT-PCR檢測。將50 μL提取液與50 μL血漿混合均勻，100 ℃保溫10 min，1 200 r/min離心5 min，取上層清液5 μL進行PCR擴增，擴增條件：93 ℃預變性2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，循環(huán)10次，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，循環(huán)30次，在退火階段監(jiān)測熒光。每次檢測都包含空白對照、陽性對照和陰性對照，判斷是否存在PCR抑制和假陽性結果。所有標本由相同的實驗人員在相同的實驗條件下進行，實驗室保持在22～25 ℃，相對濕度(65±5)%。

2 結 果

所有150份標本均被成功檢測，RT-PCR檢測過程中無抑制和假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)。各組標本在保存1、2、3、7、14、21、30 d后，人巨細胞病毒載量與0 d時比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同標本保存時間人巨細胞病毒載量

3 討 論

RT-PCR具有快速、敏感的特點，是常用的人巨細胞病毒檢測方法。但我國仍存在很多不具有病毒DNA檢測能力的實驗室，在接受造血干細胞移植后，只能將受試者的血液標本送至其他病毒學實驗室進行檢測。因此，如何優(yōu)化血液標本的采集、處理和保存，以保證人巨細胞病毒載量的檢測結果就顯得尤為重要[10]。多數(shù)在本院進行移植的患者初次人巨細胞病毒載量檢測結果為300～100 000 copy/mL。因此，本研究選取2010年9月至2014年9月在本院進行造血干細胞移植的150例患者的血漿標本(人巨細胞病毒載量為300～100 000 copy/mL)進行DNA穩(wěn)定性分析。

本研究結果顯示，低、中、高載量組標本保存1、2、3、7、14、21、30 d后，其病毒載量與保存0 d時的檢測結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Abdul-Ali等[11]研究結果顯示，血漿標本保存14 d后其中的人巨細胞病毒載量無明顯變化，與本文結果相似，但其所用的標本中有一半為陰性血漿稀釋后的標本，而且基線人巨細胞病毒載量并非真正的第0天的結果，而是放置幾天后的結果。本研究不僅選取標本有高、中、低3種不同載量的標本，還做到了在標本采集后2 h內(nèi)立即獲取基線人巨細胞病毒載量。Schafer等[12]研究顯示，人巨細胞病毒PCR結果的假陽性會因血液標本的延時處理而增高。因此，本次研究過程中每次測試前都對標本進行離心處理，以此來確保RT-PCR檢測的準確性。30 d并非研究核酸穩(wěn)定性的最長時間，Baleriola等[13]的研究中曾檢驗標本在-70～-20 ℃條件下保存9年后HBV、HIV、HCV載量的變化，發(fā)現(xiàn)病毒載量的改變對臨床判斷的影響極小。但是用于治療的生物制品中的人巨細胞病毒在保存1、5年后其載量是否有明顯變化，仍需大樣本的實驗進一步研究，評估更長標本保存時間的人巨細胞病毒DNA的穩(wěn)定性。由本研究結果可見，對于進行人巨細胞病毒載量檢測的血漿標本，如果不能當天完成檢測,則可以在30 d內(nèi)完成檢測；對于需要復檢的臨床結果，可以在排除不可預測的血漿因素后，在30 d內(nèi)重復檢測；各實驗室應針對自身條件優(yōu)化對臨床標本的保存條件。

綜上所述，血漿標本在4 ℃條件下保存30 d，不影響人巨細胞病毒載量的檢測結果。

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Influence of different storage time on giant cell viral load in plasma specimen

ZHANGLing,ZHANGQing-lu

(DepartmentofClinicalLaboratory,WeinanMunicipalCentralHospital,Weinan,Shaanxi714000,China)

Objective To study the stability of cytomegalovirus(CMV) DNA in plasma after 30 d storage under 4 ℃.Methods The plasma samples from 150 patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation were selected and divided into 3 groups according to DNA loads of human CMV:low load group(n=50,CMV DNA loads 300-1 000 copy/mL),middle load group(n=50,CMV DNA load 1 000-10 000 copy/mL) and high loads group(n=50,CMV DNA loads 10 000-100 000 copy/mL).The base line load(0 d) detection was completed within 2 d after sample collection,the other palasma was stored under the condition of 4 ℃.The human CMV load was detected on 1,2,3,7,14,30 d storage.Results The 150 samples were matched for different time points,cytomegalovirus loads of 1,2,3,7,14,21,30 days compared with baseline,the difference had no statistical significance(P>0.05).Conclusion The plasma sample after 30 d storage under 4 ℃ has no influence on the detection results of CMV load.

storage time; plasma; sample; human cytomegalovirus

張玲，女，本科，主管檢驗師，主要從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.042

A

1672-9455(2015)20-3078-02

2015-03-25

2015-07-15)