中性紅染色日本血吸蟲卵的條件探索與結果分析*

丘繼哲，王樂三，鄒 艷，黃 旭，徐妮為

(1.中南大學公共衛生學院，長沙 410013；2.湖南中醫藥高等專科學校基礎醫學部，湖南株洲 412012)

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·案例分析·

中性紅染色日本血吸蟲卵的條件探索與結果分析*

丘繼哲1，2，王樂三1，鄒 艷2，黃 旭2，徐妮為2

(1.中南大學公共衛生學院，長沙 410013；2.湖南中醫藥高等專科學校基礎醫學部，湖南株洲 412012)

中性紅染色； 日本血吸蟲卵； 條件

日本血吸蟲病是一種較為常見的易對人體健康造成威脅的寄生蟲病類型[1-2]，血吸蟲病的臨床診斷在這類疾病的預防和治療中具有十分積極的意義，免疫診斷和病原學檢查是臨床上較為常用的兩種日本血吸蟲病臨床檢查技術，免疫學診斷的方法存在一定的假陽性率，病原學檢查是確診血吸蟲感染的手段，但漏檢率高[3-4]，同時，臨床上現有的各種檢測技術操作方法均較為繁瑣，且費力費時，因而現場應用價值較低。因此提高病原學檢出率和工作效率是當前血防工作要解決的重點問題之一,解決辦法之一即為糞膜鏡下閱片自動化，然而，很長時間以來糞渣和蟲卵之間存在的反差問題未得到有效的解決，使其一直未能實現。為了對糞渣和蟲卵之間存在的反差問題進行深入分析，本課題組一直致力于對血吸蟲卵染色的研究，本次研究采用中性紅對血吸蟲卵進行染色,探索不同染色時間、不同濃度等條件對日本血吸蟲卵染色的效果及影響，以便找出最佳的染色條件，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料 中性紅、甘油、孔雀綠為國產化學純試劑；中國廈門Motic公司生產的熒光顯微鏡；北京長源實驗設備廠生產的電動勻漿機；陽性釘螺；6周齡清潔級雄性昆明小鼠5只。

1.2 配制化學染料溶液 在常規條件下實施改良加藤法(Kato-Katz)檢測，中性紅參考有關資料配制0.01%、0.05%、0.10% 3個濃度。

1.3 蟲卵糞液配制 對5只昆明小鼠實施常規法人工日本血吸蟲尾蚴感染處理，每只小鼠感染尾蚴約40尾,45 d后將其剖殺，對肝臟等器官進行收集檢測，根據余傳信等[5]提出的方法將日本血吸蟲蟲卵分離純化，用生理鹽水控制蟲卵濃度為每微升2個蟲卵，并在4 ℃的冰箱中留置保存。同時，留取10 g健康人糞便標本，使用100目和40目的尼龍網篩進行過濾處理，經過自然沉淀后去除上清液，在日本血吸蟲蟲卵溶液中加入5 mL沉淀糞渣，控制生理鹽水的蟲卵濃度為每10 μL有1個蟲卵，以此作為血吸蟲病中度感染患者的模擬糞液。

1.4 染色方法 分別取3個5 mL塑料離心管，每管加入2 mL含蟲卵糞液，中性紅配制成0.01%、0.05%、0.10% 3個濃度，每管中含有1 mL染色溶液，在30 ℃和室溫下，分別取40張涂片，每張玻片取20 μL糞液。涂片玻片分別染色5、20、30及60 min后進行鏡檢。改良加藤法按常規進行，即用玻璃紙浸于甘油-孔雀綠溶液24 h至玻璃紙呈綠色。糞渣用120目網篩除去糞渣，用標準孔板取糞渣約50 mg于載玻片上，覆以浸透甘油-孔雀綠溶液的玻璃紙，輕壓，使糞便鋪開，置36 ℃染色1 h。

1.5 結果觀察與分析 以糞渣與蟲卵的反差程度作為染色效果判斷標準，也就是糞渣著色淺或不著色，但是蟲卵著色較重，且在糞渣中十分易于辨別為最優。根據蟲卵檢出數的不同，對比分析不同各種染色條件對于日本血吸蟲蟲卵檢測的敏感性。

2 結 果

中性紅染色能夠將日本血吸蟲卵染為紅色，并將大部分的糞渣染成淺黃色，而少數糞渣則會被染為較深的顏色，以目測判斷染色效果,發現染色時間為5、20 min的玻片上蟲卵著色較淺,而染色60 min與染色30 min的著色效果無明顯差別。本實驗室室溫為10 ℃左右，通過實驗發現溫度為30 ℃時著色速度更快。故中性紅染色獲得最佳效果的條件為0.05%中性紅染色30 min，且最佳室溫條件為30 ℃。不同濃度中性紅染液對日本血吸蟲卵檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 中性紅染色對日本血吸蟲卵檢出 結果對比分析

圖1 中性紅對日本血吸蟲卵染色結果(×400)

3 討 論

在各種血吸蟲病的臨床治療和預防過程中，血清免疫學檢測和糞檢查毛蚴或蟲卵是血吸蟲病臨床診斷的主要依據。免疫學檢測技術具有較高的靈敏度，然而這一檢測方法的假陽性率較高，特異性較差，因而其現場應用價值較低，限制了技術的進一步發展和推廣應用。盡管糞便檢測是血吸蟲病診斷、治療和療效評定的金標準，但是，因為日本血吸蟲寄生于血管，且蟲卵主要附著在肝臟和腸壁等部位，僅有較少一部分能夠隨宿主糞便排出，所以，常規的糞便檢測操作方法較為復雜，且費時費力，同時，隨著近年來人們對于血吸蟲病防治工作重要性認識的逐漸深入，疫區居民的感染度和感染率均有所降低，使糞便檢測的敏感度也逐步降低，漏檢率高。對血吸蟲卵進行染色再鏡檢是提高糞檢檢出率的方法之一[6-7]，Sarvel等[8]用中性紅對曼氏血吸蟲卵進行了染色，發現用中性紅染色后蟲卵均為紅色。有其他學者亦做過用中性紅對其他寄生蟲等生物的研究[9-10]。

本次研究用不同的濃度中性紅對日本血吸蟲卵進行染色，在不同溫度和不同時間點進行觀察，發現0.05%中性紅染色的檢出率(62.5%)明顯高于改良加藤氏法檢出率(37.5%)，在30 ℃條件下染色30 min后觀察效果最佳，蟲卵為紅色，糞渣表現為淡黃色，蟲卵內結構更加清晰，辨別較為容易，中性紅染色條件的要求較低，是一種較為有效的染色方法，有望為血吸蟲卵自動檢測提供借鑒，對血吸蟲病流行區現場調查具有巨大的應用價值。

[1]利娟，朱蓉，黨輝，等．2011年全國血吸蟲病監測點疫情分析[J]．中國血吸蟲病防治雜志，2012，24(6)：627-631．

[2]鄭浩，張利娟，朱蓉，等．2011年全國血吸蟲病疫情通報[J]．中國血吸蟲病防治雜志，2012，24(6)：621-626．

[3]朱蓉,秦志強,馮婷，等．全國血吸蟲病監測點現場病原學檢測效果及質控評估[J]．中國血吸蟲病防治雜志，2013，24(6)：11-15.

[4]蘇川．我國常用血吸蟲病診斷方法面臨的問題與展望[J]．中華地方病學雜志,2013,32(6):593-594.

[5]余傳信,趙飛,殷旭仁,等.日本血吸蟲成蟲嘔吐和排泄分泌物的蛋白質組學分析[J].中國血吸蟲病防治雜志,2010,22(4):304-309.

[6] 王芳,曾慶仁,喻鑫玲,等.AKP染色鑒別組織內死活血吸蟲蟲卵的條件探索與效果觀察[J].中國病原生物學雜志,2011,6(5):336-338.

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[9]王小莉，李亮，方強，等.染色法鑒別旋毛形線蟲成蟲死活的實驗觀察[J].蚌埠醫學院學報，2011，36(10)：1041-1042.

[10]高學娟，尹文彥，陸娟，等.染色法鑒別秀麗隱桿線蟲生命狀態探究[J].廣東農業科學，2010(9)：189.

湖南省衛生和計劃生育委員會資助項目(B2012-129)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.20.068

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1672-9455(2015)20-3128-02

2015-03-25

2015-07-12)