吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進展和復發的影響

魯 誠

(南京大學醫學院附屬口腔醫院，南京 210009)

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·論 著·

吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進展和復發的影響

魯 誠

(南京大學醫學院附屬口腔醫院，南京 210009)

目的 探究吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進展和復發的影響。方法 選取2012年1月至2014年1月南京大學醫學院附屬口腔醫院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸煙者25例作為觀察組，不吸煙者25例作為對照組。抽取50例患者前臂靜脈血5 mL并離心提取血清，于血清中分別加入吸煙個體和非吸煙個體的血清200、400、800 μL至牙齦卟啉單胞菌(Pg)感染KB細胞模型，作用12 h后，使用腦心浸液瓊脂培養基對細菌進行5～7 d的培養，計數細菌菌落。使用人酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒對2組患者上清液中的基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)的濃度差異進行測定。對2組血清中分別加入不同體積血清對Pg內化KB細胞的影響和KB細胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的差異進行分析。比較2組血清中加入相同血清量Pg內化KB細胞及KB細胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1濃度的差異。結果 加入不同體積的血清后對照組個體血清Pg內化KB細胞的菌落數均明顯小于吸煙組，差異有統計學意義(P<0.05)。2組個體血清加入不同體積血清Pg內化KB細胞的菌落數差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著吸煙組血清劑量的增加，KB細胞表達MMP-1、MMP-9、TIMP-1的質量濃度增加，不同體積的血清引起MMP-1、MMP-9、TIMP-1表達的差異均有統計學意義(P<0.05)。當加入800 μL吸煙組血清與加入800 μL非吸煙組血清比較，KB細胞分泌MMP-1、MMP-9、TIMP-1的質量濃度均明顯升高(P<0.05),差異有統計學意義。結論 吸煙個體的血清能夠促進Pg內化KB細胞產生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促進慢性牙周炎的進展和復發。

吸煙； 慢性牙周炎； 基質金屬蛋白酶類

慢性牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的感染性疾病，是常見的牙齒支持組織多發疾病[1]。臨床主要表現為牙齦組織的炎性水腫出血，同時齦下菌斑和其產物對宿主細胞產生刺激并釋放出多種炎性介質，同時與宿主細胞產生免疫反應協同作用促進牙槽骨的吸收[2]。煙草中的尼古丁和可替丁能夠促進牙齦卟啉單胞菌(Pg)黏附及侵入KB細胞這一過程，進而引起并促進牙周炎的發展[3]。因此，使用吸煙個體的血清替代齦溝液能夠全面地反映煙草在Pg內化牙齦上皮細胞中的作用。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年1月南京大學醫學院附屬口腔醫院收治的50例慢性牙周炎患者，其中吸煙者25例，年齡45～75歲，平均(57.3±11.4)歲。不吸煙者25例，年齡為47～78歲，平均(55.3±10.2)歲。納入標準：(1)經臨床診斷為慢性牙周炎患者。(2)3個月內未使用過抗生素、免疫調節劑等。(3)已簽署知情書并自愿參加本項研究者。排除標準：(1)不符合上述納入標準者。(2)合并多種急慢性疾病或免疫系統疾病者。(3)嚴重精神疾患者者。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養 (1)抽取患者前臂靜脈血5 mL離心后收集血清，保存于-80 ℃。(2)常溫復蘇后，接種于新鮮配置的含1%氯化血紅蛋白、5%無菌脫纖維羊血、0.1%維生素K1的腦心浸液瓊脂培養基，置于37 ℃的厭氧環境中培養5～7 d。(3)革蘭氏染色和生化鑒定為Pg ATCC33277純培養，使用液體培養在4 ℃環境中培養24 h，并使用5 000 r/min的速率離心10 min收集細菌，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后，重懸在無抗生素的達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)培養液中，使用紫外分光光度計測量600 nm處的吸光度值，然后調節菌懸液至1×108CFU/mL作備用。(4)細菌液體在增菌后采取抽簽法抽取15個樣本，對這些樣本進行革蘭氏染色后使用PCR法鑒定Pg。

1.2.2 細胞培養 在低糖DMEM中接種常規復蘇KB細胞株ATCCCCL17，飽和適度為50 mL/L CO2和37 ℃的環境中培養傳代1～2代。在顯微鏡下可以觀察到此時細胞形態為“鋪路石”狀，在瓶底80%～90%長滿時使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的2.5 g/L的胰蛋白酶進行消化，并對細胞的質量進行計數，將細胞密度調整為2×108/L，使用2.5 mL低糖DMEM接種于6孔板上，然后繼續培養24 h后確保細胞為貼壁狀態。

1.2.3 計數細菌菌落數 貼壁狀態的KB細胞長滿6孔板的80%～90%時，細胞的數量計數結果為2.5×106個/孔，使用PBS 沖洗3次后，更換低糖DMEM并加入2.5×108CFU/mL Pg，確保感染復數為100∶1，不加入Pg的孔為陰性對照。在觀察組和對照組患者的血清中分別加入非吸煙個體和吸煙個體的血清200、400、800 μL至Pg感染KB細胞模型，不加入任何個體血清的孔為陰性對照。共同孵育2 h后每個樣本形成3個負孔，使用PBS沖洗3次后以清除未黏附到KB細胞的Pg，加入含有抗生素的DMEM孵育1 h，使用PBS洗滌4次，12 h后充分吸收500 μL上清液，在-80 ℃環境下保存。剩余的DMEM扔掉后，使用PBS沖洗4次，在每個孔中加入1 mL滅菌雙蒸水裂解細胞90 min后將懸液等比稀釋，取100 μL接種于新鮮配制的含1%氯化血紅蛋白、5%無菌脫纖維羊血、0.1%維生素K1的腦心浸液瓊脂培養基中培養5～7 d，計數細菌菌落。

1.2.4 檢測方法 按照MMP-1、MMP-9、TIMP-1試劑盒說明進行操作，使用酶標儀(瑞士，Infinite M200，Tecan company)對每個孔450 nm處的吸光度值進行測定，使用MasterPlex2010軟件將標準曲線繪制出來，并計算相應的吸光度值對應的濃度。

2 結 果

2.1 2組不同體積血清對Pg內化KB細胞菌落數的影響 研究結果顯示，加入不同體積的血清后對照組個體血清Pg內化KB細胞的菌落數均明顯小于吸煙組，差異有統計學意義(P<0.05)。2組個體血清加入不同體積血清Pg內化KB細胞的菌落數差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組不同體積血清對Pg內化KB細胞菌落數的影響

注：-表示無數據。

2.2 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生MMP-1的作用 研究結果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細胞表達MMP-1的質量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細胞表達MMP-1的影響不大。當加入200 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌MMP-1的質量濃度差異無統計學意義(P>0.05)。當加入400和800 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌MMP-1的質量濃度差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生MMP-1的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。與加入Pg的對照組相比,△P<0.05。-表示無數據。

2.3 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生MMP-9的作用 研究結果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細胞表達MMP-9的質量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細胞表達MMP-9的影響不大。當加入200和400 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌MMP-9的質量濃度差異無統計學意義(P>0.05)。當加入800 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌MMP-9的質量濃度差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生TIMP-1的作用 研究結果顯示，隨著吸煙個體血清體積的增加KB細胞表達TIMP-1的質量濃度增加，而非吸煙個體的血清對KB細胞表達TIMP-1的影響不大。當加入200 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌TIMP-1的質量濃度差異無統計學意義(P>0.05)。當加入400和800 μL血清時，2組血清中KB細胞分泌TIMP-1的質量濃度差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生MMP-9的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。與加入Pg的對照組相比，△P<0.05。-表示無數據。

表4 2組血清對Pg內化KB細胞過程中產生TIMP-1的作用

注：t1為加入Pg的觀察組與對照組相比較；t2為不加入Pg的觀察組與對照組相比較。為與加入Pg的對照組相比較，△P<0.05;與不加入Pg的對照組相比，*P<0.05。-表示無數據。

3 討 論

Pg能夠侵入到宿主細胞的上皮細胞中并存活在其中，在一定的條件下Pg能夠游移出細胞，促進慢性牙周炎的復發[4]。MMP是一族能夠降解細胞外基質的鋅離子依賴性蛋白水解酶，MMP-1是一種成纖維細胞型膠原酶，能夠降解細胞外基質中最為豐富的膠原，促進微生物感染向深部組織的擴散運動[5]。MMP-9是一種降解基底膜的重要蛋白酶，是由各種基質細胞保持酶原的形式在細胞內合成的，最終分泌到細胞外側，對骨吸收和骨組織的重建發揮作用[6]。TIMP是一種相對分子質量為2.9×104的糖蛋白，能夠調節和抑制已經被激活的MMP-9、MMP-1[7]。因此，在機體內的MMP和TIMP之間的分泌與降解過程中保持著穩定的關系，這種平衡穩定的關系能夠維護牙周組織的健康，但是煙草內有害物質的作用會打破MMP和TIMP的平衡狀態[8]。本文通過模擬慢性牙周炎患者在吸煙和非吸煙個體血清中的存在條件，Pg內化KB細胞的數量，對2種個體血清對KB細胞分泌的MMP-9、MMP-1、TIMP-1濃度的影響進行了探究，進而探究了吸煙對慢性牙周炎老年患者病情進展和復發的影響。

吸煙者的口腔衛生一般較差，牙面多堆積菌斑，且形成較多的牙石，舌側齦退縮，由于尼古丁對牙齦血管的收縮產生刺激作用，造成其血流量減少，同時吸煙使牙齦角化變厚，在牙齦下構成特定的牙周病原體，對某些藥物對特定牙周致病菌的抑制作用產生影響，因而吸煙者牙齦下對特定致病菌的感染率較高。本文研究結果顯示，患有慢性牙周炎的吸煙個體預后較差，復發率較高。這與王宏巖等[9]研究結果相同。這是由于煙草中的尼古丁和可替丁會對包括PgfimA在內的58中基因表達產生影響，而fimA基因對細菌黏附和侵入的過程發揮著重要作用，fimA基因表達上調后能夠有利于Pg對KB細胞的侵入[10]。而不同濃度的尼古丁和可替丁還能夠調節RagA等相對分子質量的表達，而這些相對分子質量的表達上調會促使細菌產生更多的能量和毒力來維持細菌內化細胞的進程[11]。同時吸煙會降低多形核白細胞(PMN)的吞噬能力和趨化性，減少患者機體的單核細胞數量和淋巴細胞的數量，當炎性反應發生時，PMN和淋巴細胞等就不能有效地殺傷、吞噬和降解組織碎片和病原微生物，導致繼發性和原發性的免疫能力低下。而本項研究中，加入不同量的吸煙者個體的血清后，與非吸煙者個體血清相比促進了Pg內化KB細胞的數量，并且隨著加入血清量的增多這種差異也越明顯。造成這種現象的原因可能為血清中的某些煙草成分通過上調Pg的某些蛋白或基因，上調了Pg侵入細胞的能力和毒力作用，也可能是由于煙草成分加速了上皮細胞的膠原降解而使促進了細菌的侵入，具體原因還需要進一步進行研究。同時煙草能夠通過造成局部缺氧環境使MMP和TIMP的表達增高。本文中加入大劑量吸煙個體血清時，KB細胞分泌的MMP-1和MMP-9的濃度也明顯升高，TIMP-1的濃度也隨之升高，這可能是由于隨著MMP-1和MMP-9的分泌增多，KB細胞代償性的分泌TIMP-1，來保持機體內MMP和TIMP的相對平衡狀態，進而保持局部組織的相對穩定和健康的狀態[12]。本研究中發現吸煙組患者在進行局部檢查時其指標存在較大的個體差異，這進一步說明吸煙是牙周炎的重要危險因素，但牙周炎是一種多因素誘發的疾病，這些因素互相拮抗且互相影響，在不同的環境和宿主中產生較大的影響，因此臨床中采用牙周治療能夠改善口腔衛生狀況去除致病因素，這種治療方法對吸煙者和不吸煙者均能夠發揮較佳的臨床療效。

綜上所述，吸煙個體的血清能夠促進Pg內化KB細胞產生MMP-1、MMP-9、TIMP-1，促進慢性牙周炎的進展和復發。也就是說吸煙患者的口腔環境會導致Pg發揮致病作用，進而促進慢性牙周炎進展和復發。

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Influence of smoking on disease progression and relapse in elderly patients with chronic periodontitis

LUCheng

(AffiliatedStomatologicalHospital,MedicalCollegeofNanjingUniversity,Nanjing,Jiangsu210009,China)

Objective To investigate the influence of smoking on disease progression and recurrence in elderly patients with chronic periodontitis.Methods 50 cases of chronic periodontitis patient in our hospital from January 2012 to January 2014 were selected,among them 25 cases of smoking were taken as the observation group and 25 cases of non-smoking as the control group.5mL of forearm blood was collected in 50 patients and centrifuged for extracting serum.The serum 200,400,800 μL in smoking individual and non-smoking individuals were added to porphyromonas gingivalis(Pg) infecting the KB cell model,after 12 h action,the brain heart infusion agar medium was used for conducting 5-7 d bacterial culturing and the bacterial colonies were counted.The human enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit was used to detect the concentration differences of matrix metalloproteinases(MMP)-1,MMP-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1) in the supernatant of two groups.The influence of adding different volumes of serum on the Pg internalizing KB cells and the differences of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were analyzed.In adding the same volume of serum,Pg internalizing KB cells and difference of KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 were compared between the two groups.Results After adding different volumes of serum,the colonies of Pg internalizing KB cells in control group individual serum were significantly less than those in the smoking group,the difference was statistically significant(P<0.05).In adding different volumes of serum in the two groups individual serum,the difference of colonies number of Pg internalizing KB cells were statistically significant(P<0.05).With increasing doses of serum in the smoking group,KB cells expressed MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were increased,the MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 expression differences caused by different volumes of serum were statistically significance(P<0.05).Comparing adding 800 μL of smoking group serum with 800 μL of non-smoking group serum,KB cells secreting MMP-1,MMP-9 and TIMP-1 concentrations were significantly increased(P<0.05).Conclusion Smoking individual serum can contribute to Pg internalizing KB cells to produce MMP-1,MMP-9 and TIMP-1,thus promote the progression and recurrence of chronic periodontitis.

smoking; chronic periodontitis; matrix metalloproteinases

魯誠，男，主治醫師，本科，主要從事口腔修復相關方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.15.026

A

1672-9455(2015)15-2204-04

2015-02-16

2015-04-15)