幽門螺桿菌ssDNA適配子的篩選及其應用

黃 震，遲秀文，蒲 榮，束振華，孫俊生，王 前

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116；2.廣東醫學院護理學院,廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第三人民醫院 523326；4.南方醫科大學南方醫院,廣州 510515)

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·論 著·

幽門螺桿菌ssDNA適配子的篩選及其應用

黃 震1，遲秀文2，蒲 榮3，束振華1，孫俊生1，王 前4△

(1.廣東省深圳市龍崗中心醫院 518116；2.廣東醫學院護理學院,廣東東莞 523808；3.廣東省東莞市第三人民醫院 523326；4.南方醫科大學南方醫院,廣州 510515)

目的 通過富集的配基系統進化技術(SELEX)篩選出與幽門螺桿菌(HP)菌體具有高親和性適配子，并且利用其檢測組織和活體內HP的感染。方法 培養HP細菌，利用SELEX篩選獲得HP菌體的適配子。在HP感染患者活檢組織驗證其結合。結果 從第6輪篩選所得ssDNA中篩選出一條高結合力的適配子命名為HP1，將適配子HP1區別于其他篩選出的適配子，并檢測其與幽門螺旋桿菌的親和力。結論 初步獲得了針對HP菌體篩選出高親和性適配子，為開發HP診斷試劑奠定了基礎。

幽門螺桿菌； 配基系統進化技術； 適配子； 診斷

目前幽門螺桿菌(HP)全球范圍內感染率高達50%以上，而在我國平均感染率約為59%,且存在著地域差異[1-2]。因此，對其早期快速診斷是治療的關鍵。傳統的方法主要分為侵入型和非侵入型診斷。鑒于傳統檢測方法靈敏度、特異度不高、誤診率高等缺點，亟待開發一種能夠快速、簡便、特異性較高的診斷方法，從而對HP感染進行診斷。本試驗選用SELEX是一種成熟的應用到各種靶標篩選的技術，包括金屬離子、藥物、氨基酸、細胞因子、抗菌藥物、全菌體、多肽等，其中蛋白質類靶分子最多[3]。有學者曾報道，以結核分枝桿菌H37Rv的菌體為靶標，篩選獲得能夠與之特異性結合的ssDNA，該適配子能夠用于診斷并阻斷H37Rv感染[4]。此外經SELEX篩選獲得的特異性結合靶分子的適配子與傳統意義上抗體相比，具有相對分子質量小，無抗原性，能夠穩定合成，同時便于熒光、生物素等多種修飾等特點，是極具應用前景的新型生物制劑[5]。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 菌株 HP標準菌株NCTC11637由中國疾病控制中心傳染病預防控制所提供。

1.1.2 試劑及儀器 引物由上海生物有限公司合成：用于克隆構建的主要試劑BamHI、EcoRI、T4 DNA連接酶等分子生物學試劑購自Fermentas公司；核酸蛋白檢測儀(德國Eppendorf公司)；紫外透射儀(Bioimaging System 美國UVP公司)；pUC19質粒、DH5a菌由本實驗室保存。

1.1.3 隨機單鏈 DNA(ssDNA)文庫的構建和引物合成 隨機(ssDNA 文庫的構建和引物合成構建了長度為 78 nt的 ssDNA 文庫,兩端為固定序列,中間40個核苷酸為隨機序列,庫容量約為 1014～1015。兩個引物中分別含有 EcoR Ⅰ和 BamH Ⅰ的酶切位點,隨機ssDNA 5-GCG GAA TTC AAC AGT CCG AGC C-N40-GGG TCA ATG CGT CAT A-3。引物 1:′5-GCG GAA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA GTC CGA GCC-3′ (劃線部分為EcoR Ⅰ酶切位點);引物 2:′5-GCG GGA TCC TAT GAC GCA TTG ACC C-3′ (劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點)。隨機 ssDNA文庫和引物由上海生物有限公司合成。

1.1.4 標本來源 由深圳市龍崗中心醫院消化科內窺鏡室提供。其中HP診斷標準為：(1)患者有典型的臨床癥狀；(2)H-E染色檢出彎曲螺旋狀桿菌；(3)HP培養陽性；(4)快速尿素酶法檢測陽性。其中任意兩項為陽性均判為陽性。

1.2 方法

1.2.1 HP的培養 布氏培養基加入去離子水800 mL，NaOH 調節pH值至7.7后補充去離子水至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。使用時按照體積比5∶1加入胎牛血清和終濃度為20%的葡萄糖。在密閉的生化培養箱中38 ℃培養，氧氣∶氮氣∶二氧化碳=5∶85∶10。

1.2.2 ssDNA文庫及雙鏈 DNA (dsDNA)的擴增 將合成的ssDNA文庫擴增為dsDNA文庫：10×Taq DNA 聚合酶buffer、單鏈寡核苷酸文庫(0.165 μg/μL)、引物Primer1(25 μmol/L)、引物Primer2(25 μmol/L)、dNTP mix(2.5 mmol/L)、Taq 酶、ddH2O 95 ℃預變性5 min,再進行95 ℃ 36 s,60 ℃ 36 s，72 ℃ 84 s，共15個循環，72 ℃延伸5 min，行3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。并以擴增所得 dsDNA文庫為模板，下游引物P2不對稱擴增出下一輪篩選的 ssDNA 文庫。反應條件同上，向PCR 產物中加入1/10體積預冷的3 mol/L的NaAc，混勻后，再向體系中加入2倍體積的冰預冷的無水乙醇，充分混勻后，置于-80 ℃沉淀4 h。

1.2.3 SELEX 篩選 取106cfu HP，加入潔凈的EP管中再加入200 μL篩選緩沖液(20 mmol/L HEPES，pH=7.4),37 ℃孵育2 h。5 000 g離心5 min棄去上清液，篩選緩沖液洗滌5次后加入200 L滅菌雙蒸水，于95 ℃加熱10 min；吸取孔中加熱后的雙蒸水做常規聚合酶鏈式反應(PCR)。為了提高篩選適配子的親和力，采用梯度篩選的方式進行，即前3輪投入106cfu HP，第4～6輪投入104cfu HP；為了提高篩選的特異性，從第2輪篩選開始通過胃黏膜細胞和其他細菌(大腸桿菌、鏈球菌、腸球菌、乳酸桿菌)進行反向篩選，將第6輪dsDNA庫，割膠回收。將dsDNA和空載pUC19用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ進行雙酶切，用割膠回收DNA片段的方法，純化回收酶切產物，測定濃度后，進行連接反應置于16 ℃，作用16 h。將連接產物轉化至DH5中，挑取單克隆，提取質粒并進行酶切鑒定。

1.2.4 相對親合力的檢測 (1)不同適配子庫與HP的親和力測定:以每輪的dsDNA庫為模板，加入以生物素標記的P1引物擴增出生物素標記的ssDNA適配子庫，用篩選緩沖液分散HP 106cfu/mL，37 ℃孵育2 h，按每管20 pmoL。每輪適配子庫做3個復孔。篩選緩沖液洗滌ssDNA-HP 3次，每次5 min，加入HRP標記的鏈酶親和素(1∶2 000稀釋)，每孔100 μL，37 ℃作用45 min，PBST洗滌微孔板3次，每次5 min。加入TMB底物，37 ℃下作用1～3 min,觀察顏色變化，然后用2 mol/L濃硫酸終止。用酶標儀讀出450 nm波長時的吸光度值。(2) 單克隆適配子庫與HP的親和力測定:以測序鑒定正確的質粒為模板，以生物素標記的P1引物擴增出生物素標記的單個適配子，方法同(1)，不同適配子庫與HP的親和力測定。

1.2.5 對臨床標本的檢測 (1)適配子HP1檢測活檢組織中的HP：收集活檢組織經臨床現有方法診斷為HP感染。共計選擇確診陽性患者27例，反復多次抗菌藥物治療患者18例，男16例，女11例，年齡26～67歲，每例標本分成兩份，一份進行臨床檢測，一份進行適配子免疫組織化學檢測。將活檢組織標本涂布于潔凈的載玻片，固定后，使用FITC標記的適配子HP1與之孵育，37 ℃ 2 h，PBS洗滌除去未結合的FITC標記的適配子3次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察視野。

2 結 果

2.1 DNA文庫及篩選產物的 PCR 擴增 化學合成的起始ssDNA 隨機文庫,經Klenow片段擴增為dsDNA文庫,然后經不對稱PCR擴增得到的ssDNA 隨機文庫，結果顯示 dsDNA 庫片段大小在 DNA marker分子100 bp附近,與預期片段大小 (78 bp)相符。通過SELEX篩選技術篩選獲得特異性結合HP的6輪ssDNA適配子庫，將各輪單鏈適配子庫行3%的DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示，隨著篩選輪數的增高，其條帶逐漸集中，說明其起始ssDNA文庫中的復雜多樣的二級結構，經SELEX篩選后，特異性結合HP靶標的ssDNA二級結構趨于一致的適配子被保留。

2.2 不同輪數適配子庫及不同克隆單適配子相對親合力的檢測 將起始文庫和篩選的6輪適配子與HP的親和力進行比較，結果顯示第六輪具有最高親和力(圖1A)，考慮到適配子文庫的豐富性隨將第6輪文庫擴增的dsDNA文庫克隆至pUC19質粒，轉化入DH5α后在經過氨芐青霉素抗性篩選后，挑取單克隆菌落，提取質粒，經酶切鑒定和測序鑒定正確的16個不同序列的單克隆適配子與HP的親和力比較，結果顯示7號適配子具有最高親和力，將結合力最高的7號適配子命名為HP1(圖1B)。

注：A為不同輪數的適配子文庫的親和力的比較；B為不同單克隆適配子的親和力的比較。

圖1 不同輪數適配子文庫親和力及不同單克隆適配子親和力的比較

2.3 對臨床標本的檢測 FITC標記的適配子HP1與活檢組織中HP特異性結合，在患者活檢組織中能夠清晰可見短桿狀的黃綠色熒光，而在正常組織對照組無熒光。經過對27例患者的活檢組織的檢出陽性率與HE染色、培養、尿素酶法的比較，結果顯示，適配子法有較高的特異性(表1)。

表1 3種方法對HP感染患者的診斷

3 討 論

HP是一種消化道致病菌，其與胃部疾病密切相關。而目前臨床診斷技術存在各種不足[6]。因此，本課題采用SELEX技術篩選與HP具有高親和力、高特異性結合的ssDNA適配子。核酸適配子是一類新型的識別分子。與單克隆抗體相比，其相對分子質量較低，沒有免疫源性，可通過化學合成制備及結構改造以及熒光、生物素等多種功能標記，化學穩定性好，能可逆的變性與復性，可在常溫下保存和運輸，這些優點使適配子在臨床診斷及治療中具有良好的應用前景[7]。

本研究采用SELEX技術經過6輪篩選后，利用ELONA方法比較了各輪適配子庫與HP的結合能力，并從親和力最高的第6輪適配子擴增為雙鏈庫并構建到pUC19的載體質粒中篩選出適配子HP1，將其應用于患者活檢組織的HP檢測中，結果顯示適配子HP1能夠在復雜的組織標本中特異性的識別結合HP，從而為臨床診斷提供依據。而本次研究仍是基于活檢組織開展，雖然適配子HP1表現出較高的靈敏度和特異度，但是仍有悖于本研究的初衷，即口服修飾的熒光標記的核酸適配子與HP在體內結合后，提供體外紅外熒光檢測其是否有HP感染，以及根據熒光強度評判感染的嚴重程度從而預測HP導致胃部疾病的風險。同時，也有研究表明適配子與靶標菌體的結合能夠阻斷細菌對宿主細胞的感染。因此，本研究篩選出的適配子HP1對HP侵襲胃黏膜細胞是否發揮作用，也值得進一步探討。

綜上所述，運用SELEX技術成功地篩選到高親和力及高特異性結合HP的ssDNA適配子，為HP感染所致疾病的鑒別診斷開辟了一條新的途徑，具有良好的應用前景。

[1]Pan Q,Wang Q,Sun X,et al.Aptamer against mannose-capped lipoarabinomannan inhibits virulent Mycobacterium tuberculosis infection in mice and rhesus monkeys[J].Mol Ther，2014,22(5):940-951.

[2]Lee YY,Mahendra RS,Graham DY.Helicobacter pylori infection——a boon or a bane:lessons from studies in a low-prevalence population[J].Helicobacter,2013,18(5):338-346.

[3]Ellington AD,Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J].Nature,1990,346(6287):818-822.

[4]Chen F,Zhou J,Lou F,et al.Aptamer from whole-bacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2007,357(3):743-748.

[5]Stoltenburg R,Reinemann C,Strehlitz B.SELEX——a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands[J].Biomol Eng,2007,24(4):381-403.

[6]Kim D,Jeong YY,Jon S.A drug-loaded aptamer-gold nanoparticle bioconjugate for combined CT imaging and therapy of prostate cancer[J].ACS Nano,2010,4(7):3689-3896.

[7]Miyakawa S,Fujiwara M,Nakamura Y.Aptamer therapeutics[J].Tanpakushitsu Kakusan Koso,2006,51(16):2521-2527.

Screening and application of ssDNA aptamers of Helicobacter pylori*

HUANGZhen1,CHIXiu-wen2,PURong3,SHUZhen-hua1,SUNJun-sheng1,WANGQian4△

(1.LongangCentralHospital,Shenzhen,Guangdong518116,China;2.NursingCollege,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China;3.DongguanMunicipalThirdPeople′sHospital,Dongguan,Guangdong523326,China;4.NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To screen the high-affinity aptamers of Helicobacter pylori (HP) by systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX) and to apply this technique to detect HP infection in tissue and in vivo.Methods HP was cultured.SELEX was applied to conduct screening for obtaining theaptamers of HP.The aptamers were used to detect the HP infection in biopsies.Results The high affinity aptamer was screened from the 6th rounds selection,named HP1.The aptamer HP1 was used to distinguish the HP from non-HP and its binding force with HP was detected.Conclusion The high-affinity aptamers binding to HP is successfully selected from the initial ssDNA library,which lays a foundation for the development of HP infection diagnostic reagents.

helicobacter pylori; SELEX; aptamer; diagnosis

廣東省深圳市科技計劃非資助項目(201203315)。

黃震，男，在職博士，副主任檢驗師,主要從事臨床免疫檢驗研究。△

,E-mail:nfyywangqian@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.012

A

1672-9455(2015)14-2006-03

2015-02-20

2015-03-20)