華蟾素抗肺癌細胞的實驗研究

盛 凱，惠萍萍，陸佳歡

(1.上海同濟大學醫學院,上海 200092;2.上海市同仁醫院消化科 200332)

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·論 著·

華蟾素抗肺癌細胞的實驗研究

盛 凱1，惠萍萍2△，陸佳歡2

(1.上海同濟大學醫學院,上海 200092;2.上海市同仁醫院消化科 200332)

目的 探究華蟾素的抗肺癌活性。方法 培養肺癌A549細胞，對華蟾素、環孢素-A(CsA)、薩菲菌素A(SfA)作用于肺癌A549細胞后的細胞存活率、細胞死亡率、細胞凋亡率以及線粒體膜電位(MMP)進行檢測；建立小鼠移植瘤模型，對華蟾素作用于小鼠移植瘤模型后的腫瘤體積以及小鼠存活率進行檢測，并整理數據進行統計學對比分析。結果 通過小鼠移植瘤模型，該研究發現華蟾素抑制了A549肺癌細胞在體內生長。研究結果表明親環蛋白D(Cyp-D)依賴的線粒體通透性轉換孔(mPTP)開放可調節由華蟾素誘導的肺癌細胞的非凋亡性死亡。Cyp-D的抑制劑環孢素-A(CsA)，mPTP的阻斷劑薩菲菌素A(SfA)極明顯地阻礙了由華蟾素誘導的線粒體膜電位(MMP)的下降和A549細胞的死亡(非凋亡)。結論 華蟾素可以誘導肺癌細胞死亡，值得進一步研究，有望成為一種新型的抗肺癌藥物。

肺癌； 華蟾素； 親環蛋白D; 線粒體通透性轉換孔; 細胞死亡

華蟾素是一種強心甾類固醇或蟾蜍二烯羥酸內酯，提取于傳統中藥蟾蜍皮膚表面分泌的油脂[1-2]。華蟾素可用作強心劑、利尿劑和止血劑應用于臨床。盡管很多研究都表明，多種癌細胞中的蟾蜍二烯羥酸內酯(如蟾蜍靈)有抗腫瘤活性和增強化療效果的特性[3]，但華蟾素潛在的抗腫瘤活性還未得到廣泛研究，且關于其內在機制的探討尚淺。線粒體通透性轉換孔(mPTP)在細胞死亡中扮演著關鍵的角色[4]。mPTP是一個通道復合體，由外膜中的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)、內膜中的腺嘌呤核苷酸轉運體(ANT)和線粒體基質中的親環蛋白D(Cyp-D)構成[5-6]。通過細胞毒素的刺激，Cyp-D和內膜中的ANT聯合，促進mPTP開放，從而導致線粒體去極化、線粒體腫脹和鈣的釋放，最終導致細胞死亡。本研究發現Cyp-D和mPTP是華蟾素誘導肺癌細胞死亡的重要調節者因素。故設計本實驗，對華蟾素抗腫瘤活性進一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 A549、H460、HTB-58及HEK-293人肺癌細胞系購自上海中國醫學科學院細胞庫。

1.2 儀器與試劑 華蟾素、薩菲菌素A(SfA)和環孢霉素A(CsA)由美國Sigma公司制備；Z-VAD-fmk(ZVAD)購自上海Calbiochem公司；Cyp-D抗體和微管蛋白購自美國Santa Cruz生物制藥公司。培養基為含10%胎牛血清(FBS，購自上海Hyclone公司)的DMEM，加入抗生素，在37 ℃，體積分數為5%的CO2溫育箱中培養。

1.3 方法

1.3.1 細胞存活率檢測 用四唑染色法(MTT法)檢測細胞存活率。將細胞接種于96孔板中處理，每孔中加入5 mg/mL的MTT(溶于磷酸緩沖液PBS)，然后培養3 h。待介質通氣后，每孔中加入150 μL的DMEM。輕搖孔板至呈色反應均勻，且酶標儀測出OD值為OD 490。只由介質處理的細胞存活率為100%，細胞存活率=試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3.2 細胞死亡率檢測 細胞經過處理后，再計量死亡細胞數(用臺盼藍染色，死細胞呈藍色陽性反應)。細胞死亡率=經臺盼藍染色后呈藍色陽性反應的細胞數/總細胞數×100%。細胞總數由細胞計數器自動記錄。

1.3.3 細胞凋亡率檢測 將細胞接種于6孔板中，當細胞生長至70%～80%時進行實驗。每孔加入被測試劑，培養至指定時間點。用Trypsin-EDTA消化法收集細胞。在70%冷乙醇固定細胞后，在37 ℃下，用5 mg/mL碘化丙啶(PI)和1 mg/mL Annexin V將細胞染色30 min。之后在流式細胞儀上對樣本進行檢測，每個樣本中含10 000個細胞。Annexin V 百分比反應細胞凋亡率。Annexin V 陽性、PI陰性以及Annexin V 陽性、PI陽性的細胞合為凋亡細胞。

1.3.4 MMP的檢測 用JC-1染色法測量MMP。JC-1染料聚集在線粒體膜內，在正常靜息細胞中發出橘色熒光。當膜電位降低時，JC-1單體在胞液內形成，發出綠色熒光。因此，通過檢測綠色熒光強度來檢測MMP的降低程度[7]。簡而言之，經過處理后，在黑暗中，用5.0 μg/mL JC-1染色A549細胞。用溫和的PBS沖洗細胞兩次，在新鮮的培養基中再次懸浮細胞，再立即用含485 nm感光濾光片的酶標儀讀取OD數值。試驗組的OD數值規范化為介質對照組的OD數值。

在接受1 μmol/L華蟾素刺激之前，先將A549細胞用0.1 μmol/L CsA或 SfA培育1 h，再分別用MTT法和臺盼藍染色法分析細胞活性和凋亡情況。用JC-1染色法檢測MMP降低情況。用1 μmol/L華蟾素刺激A549細胞內scramble shRNA、Cyp-D shRNA-1及Cyp-D shRNA-2的穩定表達。用1 μmol/L華蟾素或含0.1 μmol/L CsA的華蟾素處理HEK-293細胞表達對照組或0.5 μg/每孔的Cyp-D載體72 h。

1.3.5 動物 公裸鼠4～6周大，為BALB/c小鼠，購自上海中國醫學科學院實驗動物研究所。所有試驗根據作者所隸屬的實驗動物研究委員會之實驗動物護理和使用指南實施。

1.3.6 肺癌A549裸鼠移植瘤模型 如先前研究所述，公裸鼠被用來建立肺癌A549移植瘤模型。在小鼠的右股皮下注射A549細胞(0.1 mL培養基中含500萬個細胞)，當腫瘤達到200～300 mm的平均量時進行實驗。將22～25 g、6～8周大的裸公鼠貼上耳標，小鼠被隨機分為3組，每組含10只小鼠，每組分別加入：(1)載體；(2)1.0 mg/kg華蟾素；(3)5.0 mg/kg華蟾素。再在皮下接種0.1 mL培養基中的2 ×106個A549細胞。接種6 d后開始實驗。小鼠腹腔注射華蟾素，每天2次，連用1周。每天對小鼠進行檢查，確定與實驗相關的不良反應和死亡率。用卡尺測量腫瘤體積，每周1次，連測5周。在第5周時，也要測量小鼠的體質量和存活率。腫瘤體積(按mm3計)按以下公式計算：體積=(短徑2×長徑)/2。

2 結 果

2.1 不同濃度華蟾素誘導肺癌細胞的毒性作用 0.1 μmol/L的華蟾素作用于A549細胞72 h后，測出的細胞存活率、細胞死亡率以及細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；0.5 μmol/L的華蟾素的細胞存活率低于對照組，細胞死亡率以及細胞凋亡率高于對照組，各項指標與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 華蟾素對肺癌細胞A549的毒性作用與Cyp-D抑制劑CsA和mPTP阻斷劑SfA的關系 華蟾素誘導經CsA和SfA處理過的肺癌細胞A549后，細胞存活率均低于對照組，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，細胞死亡率均高于對照組，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，MMP降低均高于對照組，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 不同濃度華蟾素作用于A549細胞后的結果

注：Ct代表介質處理的對照組，與對照組比較，*P<0.05。

表2 華蟾素作用于經CsA和SfA處理后肺癌細胞A549的結果

注：Ct代表介質處理的對照組，與對照組比較，*P<0.05。

2.3 華蟾素抑制活體內肺癌A549細胞的生長 用小鼠肺癌A549細胞移植瘤模型檢測體內華蟾素的抗癌活性，使用1、5 mg/kg華蟾素，第5周時小鼠體內的腫瘤體積小于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且5 mg/kg組小于1 mg/kg組，見圖1。使用1、5 mg/kg華蟾素的腫瘤小鼠第5周存活率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且5 mg/kg組高于1 mg/kg組，見圖2。

圖1 不同時間不同濃度華蟾素作用于腫瘤模型小鼠后的腫瘤體積

圖2 不同濃度華蟾素作用于腫瘤模型小鼠5周后小鼠的存活率

3 討 論

長期以來，細胞壞死性死亡被認為是非程序性的，但最近細胞壞死被證明和細胞凋亡一樣，也是一個程序化過程。與缺血再灌注損傷、氧化應激、化療藥物和紫外線誘導細胞死亡一樣，程序性細胞壞死也是導致細胞死亡的重要原因[8-9]。有研究表明，阿霉素誘導細胞死亡主要是因為細胞程序性壞死，而不是細胞凋亡。另有研究顯示，Cyp-D及其調節的mPTP開放可能在細胞程序性壞死過程中扮演著重要角色。大部分研究提示，Cyp-D轉移到線粒體內膜后，和線粒體內膜中蛋白質ANT形成復合體，指導mPTP開放，導致線粒體去極化，最終導致細胞壞死。

所以作者在前期通過華蟾素誘導肺癌細胞產生毒性作用后，測試了Cyp-D對華蟾素誘導肺癌細胞產生毒性作用的重要性。本研究結果顯示Cyp-D抑制劑CsA和mPTP阻斷劑SfA嚴重抑制了Dox誘導的A549細胞活性的降低和死亡，華蟾素誘導的細胞毒作用受到了CsA和SfA的阻礙。而且華蟾素降低了A549細胞中的MMP，使mPTP得到開放。以上結果表明，Cyp-D能調節由華蟾素誘導的mPTP開放和隨后肺癌細胞的非凋亡性死亡。所以華蟾素很有可能成為一種新型抗肺癌藥物，但仍需進一步研究證實。

[1]Son MB,Gauvreau K,Burns JC,et al.Infliximab for intravenous immunoglobulin resistance in Kawasaki disease: a retrospective study[J].J Pediatr,2011,158(4):644-649.

[2]Emam H,Zhao QL,Furusawa Y,et al.Apoptotic cell death by the novelnatural compound,cinobufotalin[J].Chem Biol Interact,2012,199(3):154-160.

[3]Yin PH,Liu X,Qiu YY,et al.Anti-tumor activity and apoptosis-regulation mechanisms ofbufalin in various cancers: new hope for cancer patients[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5339-5343.

[4]Javadov S,Kuznetsov A.Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilind[J].Front Physiol,2013,11(4):76.

[5]Lu JH,Shi ZF,Xu H.The mitochondrial cyclophilin D/p53 complexation mediates doxorubicin-inducednon-apoptotic death of A549 lung cancer cells[J].Mol Cell Biochem,2014,389(1/2):17-24.

[6]Zhen YF,Wang GD,Zhu LQ,et al.P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts[J].J Cell Physiol,2014,229(10):1475-1783.

[7]Vaseva AV,Marchenko ND,Ji K,et al.p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis[J].Cell,2012,149(7):1536-1548.

[8]Chen B.Cisplatin-induced non-apoptotic death of pancreatic cancer cells requires mitochondrial cyclophilin-D-p53 signaling[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,437(4):526-531.

[9]Ji C.Ultra-violet B (UVB)-induced skin cell death occurs through a cyclophilin D intrinsic signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,425(4):825-829.

Experiment study of cinobufagin anti-cancer effect on lung cancer cells

SHENGKai1,HUIPing-ping2△,LUJia-huan2

(1.MedicalCollege,ShanghaiTongjiUniversity,Shanghai200092,China;2.DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTongrenHospital,Shanghai200332,China)

Objective Explore the potential of Huachan element resistance to lung cancer.Methods Cultivate the A549 lung cancer cells.After HuaChan element and cyclosporine A(CsA), safi rhzomorph A (SfA) role in the A549 lung cancer cells，testing cell survival and cell death, cell apoptosis rate and mitochondrial membrane potential (MMP).Establish the mice transplanted tumor model，After HuaChan element role in the mice transplanted tumor model, testing the tumor volume and the survival rate of mice. And collates data for statistical analysis.Results By mice transplanted tumor model,Data show that cyclophilin D (Cyp,cyclophilin D-D) rely on mitochondrial permeability transition pore (mitochondrial permeability transition pore,mPTP) open the adjustable by Huachan induced lung cancer non apoptotic cell death.Cyp inhibitors-D part of spore element-A (cyclosporine A,CsA),the blocker mPTP safi rhzomorph A (sanglifehrin A,SfA) extremely significantly hindered by Huachan induced mitochondrial membrane potential (mitochondrial membranepotential,MMPs) fall and A549 cell death (apoptosis).Conclusion The study found that Huachan inhibit the growth of the A549 lung cancer cells in the body.Research results show that HuaChan element is worth further study,as a new type of lung cancer drug resistance.

lung cancer; Huachan element; cyclophilin D; mitochondrial permeability transition pore

盛凱，男,在讀研究生,主治醫師,主要從事呼吸道相關腫瘤的研究。△

，E-mail：realhuiping@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.14.019

A

1672-9455(2015)14-2023-03

2015-01-25

2015-03-18)