手工法和全自動機器法查找結核桿菌效果比較

戴 蕓，張 玨，喬 昀

(上海市中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科 200021)

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·臨床探討·

手工法和全自動機器法查找結核桿菌效果比較

戴 蕓，張 玨，喬 昀△

(上海市中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科 200021)

結核分枝桿菌；抗酸染色；全自動染色機

結核病是由結核分枝桿菌侵入人體后引起的一種慢性傳染性疾病，并具有較強的傳染性，中國是全球22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核患者數居世界第2位。每年因結核病死亡的人數是其他傳染性疾病總死亡人數的2倍以上[1-2]。抗酸染色法是結核桿菌細菌學檢查的常用方法，也是考核療效、評價治療效果的可靠標準[3]。其特點為快速、簡便、實用，檢出時間短，對器械要求不高，一直被基層醫院使用，但該方法的染色溫度及時間不容易掌握，在開放空間進行，有傳染風險。因此，準確、快捷且安全的染色方法對于結核病的早期診斷和及時治療具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集本院2013年1月1日至2014 年6月30日門診及住院患者痰標本共1 396份,其中確診為結核患者痰標本346份，非結核患者痰標本1 050份。所有標本由患者清晨漱口后咳出的深部痰液，放置于無菌痰盒內。按《中國結核病防治規劃涂片鏡檢質量保證手冊》制作2張盡可能一致的涂片。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 全自動抗酸染色儀DL-DYE-ACID及原裝試劑，由珠海迪爾生物有限公司生產。

1.2.2 染色液 由珠海貝索生物技術有限公司生產，染液由石碳酸復紅溶液、酸性乙醇溶液、亞甲藍溶液組成,均在有效期內使用。

1.2.3 其他 全新玻片、顯微鏡(Olympus CX21)、生物安全柜(STERILCKER GARO4)。

1.3 方法

1.3.1 選取上海市臨檢中心的陽性質控片20張，各使用10張進行手工染色和機器染色。

1.3.2 涂片 用接種環挑取適量痰液，制成20 mm×15 mm大小的厚膜涂片。每份標本涂抹2張涂片,分別用于手工法與機器法染色。盡量使每份標本的2張涂片在取痰部位、痰膜厚薄、痰膜大小一致。

1.3.3 手工染色 初染：將涂片置于染色架上滴加石碳酸復紅液蓋滿玻片靜置15 min。脫色：流水輕緩沖洗以沖去初染液,瀝出玻片上的水,滴加鹽酸乙醇脫色劑至痰膜無可視紅色為止。復染：流水輕緩沖洗以沖去脫色液,瀝出剩余的水,滴加亞甲藍復染液染色30 s 后,流水輕緩沖洗沖去復染液。

1.3.4 自動染色 按儀器操作規定先觀察試劑充足情況，然后調節水壓，打開電磁閥沖水觀察水流狀況同時調節水流使噴水口的水流至轉盤而不濺起水花，且水流至噴水口時為線狀快掉落轉盤時為斷續水珠狀。再按機器順序及位置裝載玻片，在主操作界面上設置玻片數量，后按確定即進入染色循環。完成后取下已染色的玻片放置在烤片機加熱槽中加熱固化以待鏡檢。

1.3.5 顯微鏡鏡檢及結果判斷 嚴格按《結核病實驗室診斷檢驗規程》和試劑說明書進行。鏡檢結果報道如下，抗酸桿菌陰性:連續觀察300個不同視野,未發現抗酸桿菌?？顾釛U菌陽性(±)：報告抗酸桿菌菌數為1～8條/300個視野。抗酸桿菌(+)為3～9條/100個視野,連續觀察300個視野?？顾釛U菌(++)為1～9條/10個視野,連續觀察100個視野?？顾釛U菌(+++)為1～9條/每個視野,連續觀察50個視野?？顾釛U菌(++++)為≥10條/每個視野,連續觀察50個視野。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0進行數據分析，計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 自動染色機進行質控片染色結果 機器法染色效果見圖1，在藍色背景下可見清晰的紅色抗酸桿菌，染色效果較好。

圖1 全自動染色機染色效果

2.2 手工法與自動染色法陽性結果比較 見表1。由表1可見，全自動染色機法與手工法染色陽性結果在結核組與非結核組差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 手工法與自動法染色陽性結果比較[n(%)]

2.3 手工法與自動法染色結果比較 見表2。由表2可見，全自動染色機法與手工法染色經鏡檢各級結果差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 手工法與自動法染色各級結果比較(n)

3 討 論

長期以來，結核病的實驗室診斷方法主要依賴涂片抗酸染色鏡檢、結核菌培養法及聚合酶鏈反應(PCR)等方法，但是，傳統的改良羅氏培養法細菌生長周期長(4～8周)易延誤患者病情與治療。熒光定量PCR技術雖然有靈敏度高、特異性強、快速等優勢，但是，此檢測方法對實驗環境和操作技術都有很高標準的要求,不利于基層結防控制機構的工作。人工操作染色涂片也存在操作繁瑣、耗時長、不能標準化、難以質控及浪費染色液的問題，而且人工操作還存在一定的開放性傳染風險。據有些報道，實驗室工作人員結核患病風險為普通人群的7～79倍[4]。因此，準確、快捷且安全的染色檢測方法對于結核病的早期診斷和及時治療具有十分重要的意義。

全自動抗酸染色機具有較多優點：(1)操作簡單，只要在主界面設置染片數量即開始染色循環且一次最多可以染8張涂片，利于基層實驗室開展工作。(2)能定量加液模擬手工染色避免浪費染色液，并且儀器內置染色液能有效保護染色液。(3)采用“微量浸泡技術”，保證染液與涂片充分接觸，內置獨特轉盤杜絕玻片之間交叉污染，同時低速脫水保護標本不脫落。(4)在生物安全方面，自動染色機內置染色液具備自動清洗功能，能防止儀器內部污染，同時其封閉式染色系統減輕了結核菌對實驗室工作人員的職業危害。(5)具備自動清洗功能，杜絕儀器內部污染，保護儀器長期使用。

本試驗結果表明,在用抗酸染色查找痰中結核桿菌時,無論是陰性還是陽性痰標本,手工法和自動法在檢測結果上其差異均無統計學意義，由此提示使用全自動抗酸染色機查找痰涂片中結核分枝桿菌在臨床診斷中具有一定臨床意義。但是同許多研究一樣，本次試驗發現痰涂片染色找抗酸桿菌的其敏感性太低，僅分別為30.92%和34.39%。這是因為抗酸染色受痰中細菌數量限制，一般至少每毫升痰液含5 000～10 000個細菌方可得出陽性結果;且結核病患者是間斷性排菌，可能造成假陰性造成漏診[5-6]。另外干擾因素多，系統及人為引起的誤差大。

因此，在實驗室允許的條件下，結合其他診斷方法有一定的臨床需要。

[1]Jasmer RM,Nahid P,Hopewell PC.Latent tuberculososis infection[J].N Engl J Med,2002,347(23):1860-1866.

[2]Lee E,Holzman RS.Evolution and current use of the tuberculintes[J].Clin Infect Dis,2002,34(3):365-370.

[3]劉卓然.三種方法聯合檢測肺結核病人痰液和支氣管刷洗物中結核桿菌的臨床意義[J].實用預防醫學，2008，15(6)：1938-1939.

[4]Joshi R,Reingold AL,Menzies D,et al.Tuberculosis among health-care workers in low-and middle-income countries:a systematic review[J].PLoS Med,2006,3(12):e494.

[5]徐蓉.熒光定量PCR 檢測結核桿菌DNA 與涂片抗酸染色結果的對照分析[J].中外醫學研究，2012，10(1)：62-63.

[6]戴佩佩.三種檢測方法對活動性結核病的臨床診斷價值[J].中國衛生檢驗雜志，2011，21(7)：1748-1749.

△通訊作者，E-mail:qiaoyun1252@live.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.23.046

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1672-9455(2015)23-3558-02

2015-03-18

2015-06-20)