基于流式細胞術診斷結核感染的研究進展

吳 凡，孫 林，張曉明，焦新安

基于流式細胞術診斷結核感染的研究進展

吳 凡1,2，孫 林1，張曉明2，焦新安1

結核病是危害人類健康的一種傳染病，快速診斷與合理治療是控制結核病的關鍵，然而對于潛伏性結核感染仍缺少診斷的金標準。目前，結核菌素皮試以及IFN-γ釋放試驗被視為診斷是否感染結核的有效方法，它們通過間接檢測受試者對結核分枝桿菌的細胞免疫反應做出評判，但這兩種方法均存在缺陷，也無法明確區分潛伏性感染和活動性結核。流式細胞術作為一項高新技術已經在醫學臨床領域得到廣泛應用。近年來，流式細胞術檢測胞內細胞因子技術在結核感染的診斷及療效評價等方面取得了一定進展。本文對應用流式細胞術進行結核感染診斷的進展進行綜述。

結核；診斷；γ-干擾素；流式細胞術

結核病至今仍是嚴重危害人類健康的全球性疾病，根據世界衛生組織統計，每年約有800多萬新增病例，150多萬人死于該病[1]。流行病學模型表明只有實行有效的疫苗政策、對結核感染者以及發病者進行準確診斷和高效治療，才有望徹底消除結核病[2]。結核分枝桿菌是一種細胞內緩慢生長的致病性微生物，也是人類結核病的病原體，感染初期，大多數人的天然防御機制會起到保護宿主清除病原體的作用，但作為胞內寄生菌，結核分枝桿菌往往可以借助復雜的逃逸機制來逃脫巨噬細胞的殺傷并在細胞內長期存在。人們通常將那些沒有表現臨床癥狀的潛伏感染者視作不具有傳染威脅，然而潛伏感染者仍有可能發展成活動性患者，所以對潛伏感染者的診斷治療是有效降低發病風險、控制結核的關鍵所在。結核潛伏感染者并不表現出臨床癥狀，細菌呈現休眠狀態，所以對于潛伏感染的診斷難度較大。近年發現，由于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)并發、與結核病人親密接觸或者藥物治療導致免疫下降等原因，潛伏感染者發展成結核病人的風險不斷提高，這就對結核病的早期診斷提出了更高要求。

目前用于結核病診斷的方法主要有胸部X光攝片、細菌培養、結核菌素皮試(tuberculin skin test, TST)和IFN-γ釋放試驗(interferon-γ release assays, IGRAs)。傳統的檢測方法周期長、檢出率低、漏診率高，導致結核菌繼續傳播和病人治療延誤。TST和IGRAs以宿主發生的細胞免疫反應作為間接診斷的標志，卻無法區分潛伏感染和活動性結核病，也尚不能判定結核感染的具體階段，對于免疫缺陷的病人TST和IGRAs檢測的敏感性都有所降低[3]。隨著流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)在臨床檢驗中的應用與推廣，以FCM為基礎檢測胞內細胞因子的技術手段在結核診斷及療效評估等方面顯現出誘人的前景。

1 FCM檢測胞內細胞因子技術

細胞因子即那些可調節細胞和組織存活、生長、分化以及功能的分泌性蛋白，一種細胞因子通常會參與體內多種生物反應，并且在大多情況下協同發揮功能效應。細胞因子在對抗傳染性病原體的天然免疫保護中有著重要的作用，是機體主要的細胞免疫防御機制，在不同疾病狀態或免疫狀態下的T細胞效應通常與細胞因子基因表達和/或分泌的相對比例相關聯[4]。早期分析單個細胞分泌細胞因子的方法有酶聯免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和原位雜交等，但均存在費時耗財的劣勢[5]，近年來有研究者開始嘗試運用FCM分析細胞因子。

FCM是對處于液流中的細胞或其他各種微粒進行多參數快速分析和分選的技術，可以對細胞膜、細胞質中的蛋白、細胞因子、其他各種特異標志以及細胞核中的核酸蛋白進行分析。自20世紀80年代后期，隨著流式細胞儀的發展和熒光素標記抗體的開發，FCM已普遍應用于細胞生物學、免疫學、腫瘤學、遺傳學、臨床檢驗學等眾多領域。FCM能通過細胞內免疫熒光染色，直接檢測與細胞因子特異性結合的抗體，快速測定出細胞亞群產生的細胞因子并加以定量分析，同時不會受細胞濃度、受體溶解等因素的影響。其方法是在抗原刺激細胞產生細胞因子時用蛋白轉運阻斷藥物擾亂高爾基體轉運系統，使細胞因子在細胞質中積累，再通過固定使細胞保持形態，破膜劑使流動的、完整的細胞膜產生小孔以利于抗體進入細胞，細胞因子抗體穿過細胞膜與胞內細胞因子特異性結合，即可用FCM進行檢測。FCM檢測胞內細胞因子技術，為抗原刺激后特異性淋巴細胞的功能評估提供了獨一無二的平臺，有利于揭示免疫系統在疾病發病機理中的作用，同時也為臨床早期診斷和治療提供重要依據。

2 FCM檢測胞內細胞因子技術對結核感染的診斷研究

利用FCM檢測胞內細胞因子技術(intracellular cytokine flow cytometry,ICC)進行結核感染診斷的原理是：IFN-γ是介導細胞免疫應答的重要細胞因子，被結核分枝桿菌致敏的T淋巴細胞再次受到相關抗原刺激后會釋放IFN-γ[6-7]，通過檢測分泌IFN-γ的效應T細胞數量，可以判斷是否感染結核分枝桿菌。早期分泌抗原靶標6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)由BCG和大多數非結核分枝桿菌中普遍缺失的RD1區域編碼[8]，具有較高的特異性，所以常用作結核檢測實驗的刺激抗原。

3 FCM檢測胞內細胞因子技術的應用評估

4 FCM區分活動性結核病和潛伏感染的探索

結核菌素皮試以及IFN-γ釋放試驗被視為診斷是否感染結核的有效方法,但也無法明確區分潛伏性感染和活動性結核，隨著流式細胞術的價值體現，研究者們嘗試從中找到一些新的啟發。

目前，很多報道提出脂阿拉伯甘露糖(Lipoarabinomanna,LAM)、16 kDa和38 kDa等結核抗原蛋白，在檢測結核病患者方面均有較高的敏感性和特異性，展現了較好的應用前景。但目前這些蛋白作為結核特異性抗原用于流式檢測的研究并不多，這或許為FCM技術在結核領域的應用提供了新的思路。

結核帶給人類的損失是不可估量的，而對于其早期診斷，目前尚無統一的金標準，相比于PPD試驗，IGRAs的特異性和敏感性均有明顯的提升，但在某些復雜情況下仍無法給出準確的診斷。流式細胞術不僅可以同時檢測多種細胞因子，還可以確定產生細胞因子的細胞亞型，是一種相對快速準確定量細胞因子的方法，雖然胞內細胞因子染色技術在結核領域的應用國內尚未普及，隨著FCM的廣泛應用，很有希望發展成為一種新的結核感染診斷工具，并且在生物學領域有著巨大的潛在價值。

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Tuberculosis diagnosis based on Flow Cytometry

WU Fan1,2,SUN Lin1,ZHANG Xiao-ming2,JIAO Xin-an1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.InstitutPasteurofShanghai,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China)

Tuberculosis (TB) is an infectious disease endangering people’s health around the world, and diagnosis and rational treatment are the key to control TB. However, currently there is no diagnostic golden standard for latent tuberculosis infection (LTBI). The tuberculin skin test and IFN-gamma release analysis are regarded as effective methods for TB diagnosis, which is based on host’s cellular immune response to mycobacterial antigens. But the two methods are not perfect; neither test can make a clear distinction between latent infection and active TB. Flow Cytometry (FCM) has been widely used in the field of clinical medicine. In recent years, substantial advances have been achieved in the fields of TB diagnosis and evaluation of treatment efficacy by using the FCM intracellular cytokine detection technology. In this paper, we will review the latest progress in tuberculosis diagnosis research by using flow cytometry in recent years.

tuberculosis; diagnosis; IFN-γ; flow cytometry

s:Jiao Xin-an, Email:jiao@yzu.edu.cn

國家青年科學基金(31201882)，江蘇省高校自然科學基金(12KJB230001)和中國科學院對外合作重點項目資助(No. GJHZ201312)聯合資助

焦新安，Email:jiao@yzu.edu.cn

1.揚州大學，江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇省重要動物疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009； 2.中國科學院上海巴斯德研究所，上海 200031

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.014

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0963-04

2015-03-30；

2015-08-09

Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China (No. 31201882) , the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (No. 12KJB230001), and the External Cooperation Program of Chinese Academy of Sciences (No. GJHZ201312).