eha基因調控遲緩愛德華菌的毒力

盛安康，李玉紅,張 坡，祝如愿，刁亦非，周佳瑩，高大慶，陸承平

eha基因調控遲緩愛德華菌的毒力

盛安康1，李玉紅1,張 坡1，祝如愿1，刁亦非1，周佳瑩1，高大慶1，陸承平2

目的eha基因是E.tarda毒力株ET-13一個重要的轉錄調控基因，本文研究其對該菌株毒力的影響。方法 利用菌落計數法比較野生株和eha缺失株感染小鼠毒力(LD50)的差異,以及比較兩菌株在小鼠每個肝臟、脾臟和腎臟中細菌菌落數目的差異；利用組織HE染色觀察兩菌株對宿主組織損傷的差異；利用RT-PCR，比較兩種細菌毒力基因表達的差異。結果eha缺失株相比野生株其毒力下降了2.5倍；eha缺失株在宿主體內的生存能力明顯降低。小鼠感染野生株后，出現肝細胞水腫和中性粒細胞浸潤，脾小體內細胞壞死，腎小管水腫等病變，以及上述臟器外觀出現改變。提示野生株對小鼠的肝臟、脾臟和腎臟有毒性作用，而eha缺失株對上述臟器無明顯毒性作用。RT-PCR結果顯示，eha基因的缺失使得E.tarda菌的Ⅲ型分泌系統分泌蛋白基因eseC和外膜蛋白基因(pagC)的轉錄水平下降，菌毛蛋白基因(fimA)的轉錄水平沒有改變。結論eha基因缺失后，E.tarda菌 ET-13株的毒力因子表達降低，使該菌毒力明顯減弱，對宿主的致病性和病理損傷減輕。因此，eha基因是一個毒力正調控基因。

eha基因；E.tarda；毒力

遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda，E.tarda)屬于腸桿菌科愛德華菌屬，分布廣泛，可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類及哺乳類等。E.tarda能夠引起多種魚類感染，是水產養殖業的重要病原體[1]。E.tarda也可感染人，可引起人的胃腸炎、敗血癥和腦膜炎等多種疾病。高大慶等用鳥槍法在E.tarda中發現的一個溶血活化基因(E.tardahaemolysin activator gene，簡稱eha)，前期的研究表明Eha蛋白是一個重要的轉錄調控因子，能夠調控E.tarda的某些毒力因子，并通過自殺質粒和同源重組原理，獲得ET-13毒力株的eha缺失株[2-4]。

本研究首先建立E.tarda菌感染小鼠模型，比較ET-13毒力株野生型和eha缺失型毒力的差異，并比較兩者在宿主體內的生存能力的差異和對宿主損傷的差異，進一步比較兩種細菌毒力基因表達的差異，明確 Eha蛋白是一個影響E.tarda毒力的正調控因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養基E.tarda毒力株ET-13由南京農業大學陸承平教授惠贈。ET-13的eha缺失株(Δeha)和Δeha互補株(ehaComp)由本室保存[3]。細菌采用LB(Luria Broth)培養基來培養。

1.1.2 實驗動物 BALB/c二級小鼠，6 w齡，雌性，購自揚州大學動物模式中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌菌液準備 離心收集對數期細菌，無菌PBS清洗2次細菌沉淀后，細菌重懸至 OD600為0.5(約108cfu/mL), 10倍梯度稀釋菌液, 取合適稀釋度涂布于LB平板, 進行菌落計數。

1.2.2 細菌小鼠毒力實驗(LD50) 采取腹腔注射的方式感染小鼠，接種每只小鼠的細菌劑量依次為106、5×106、107、5×107、108、5×108和109(colony formation unit, cfu)，每只小鼠200 μL。112只小鼠分為兩大組，分別用野生株和缺失株感染。每大組內按照接種細菌劑量不同，分為7小組，每小組8只。在感染后28 d內觀察小鼠死亡情況，并記錄數據，采用RM6240生物信號采集處理系統軟件，分別計算野生株和缺失株的半數致死量(median lethal dose ，LD50)。

1.2.3 細菌在小鼠體內存活實驗 實驗動物分為2組：野生株組和eha缺失株組。接種每只小鼠的細菌劑量5×106cfu /mL，每只小鼠200 μL；在感染后不同時間點(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d)，每個時間點斷脊處死每組5只小鼠，無菌操作迅速取出肝臟、脾臟和腎臟加入1 mL含有0.1%TritonX-100的PBS，用玻璃勻漿器制成勻漿，取組織勻漿進行10倍系列稀釋，選取適當稀釋度的勻漿液100 μL涂LB平板，計算每個時間點每組細菌菌落數目的平均值。

1.2.4 細菌感染后小鼠脾臟和肝臟病理的改變: 實驗動物分為3組(9只/組)：野生株組、eha缺失株組和PBS對照組。接種每只小鼠的細菌劑量5×106cfu /mL，每只小鼠200 μL；在感染后1 d、3 d和5 d 斷脊處死小鼠，迅速解剖，取出小鼠的肝臟、脾臟和腎臟組織進行觀察和稱重，計算器官重量；先用PBS洗去血液，再浸于10%中性福爾馬林溶液中固定48 h；經沖洗、脫水、常規石蠟包埋，制成4 μm～5 μ m切片后進行蘇木素-伊紅(HE)染色，Olympus BX50生物顯微鏡觀察。

1.2.5 RT-PCR 按Trizol試劑盒說明書，提取細菌RNA,取2 μg RNA逆轉錄成cDNA。再以cDNA為模版，用Ⅲ型分泌系統的分泌蛋白基因(secretary protein,eseC)、菌毛蛋白基因(fimbria，fimA)和外膜蛋白基因(pagC)的引物(見表1)，分別擴增上述基因，以擴增16S rRNA基因作為內標參照，半定量檢測各基因的轉錄水平。

表1 RT-PCR引物序列和產物

2 結 果

2.1 腹腔注射ET-13毒力株感染小鼠的毒力實驗(LD50)結果如表2所示，采用RM6240生物信號采集處理系統軟件，計算出野生株對小鼠的LD50(半數致死量)為4.64×107cfu；eha缺失株對小鼠的LD50(半數致死量)為12.7×107cfu，eha缺失株的毒力低于野生株的毒力約2.5倍，因此，eha基因能夠增強E.tarda菌ET-13株的毒力。

2.2 比較野生株和缺失株感染小鼠后(腹腔注射)，在肝、脾和腎中細菌存活數目的差異。如圖1顯示, 和野生株比較，缺失株雖然也入侵肝臟(1A)、脾臟(1B)和腎臟(1C),但在這些器官內檢出的細菌數量明顯低于野生株，而且很快被清除，表明eha缺失株在宿主體內的生存能力明顯降低。

2.3 比較野生株和缺失株分別感染小鼠后，其肝臟、脾臟和腎臟外觀的差異 在解剖小鼠時發現，感染野生株組小鼠的器官外觀均大于缺失株組和對照組。感染3 d后，野生株組小鼠的脾臟外觀顯著大于缺失株組和對照組；感染5 d后，野生株組小鼠的肝臟和腎臟 外觀顯著大于缺失株組和對照組；而感染缺失株組后,小鼠的器官外觀和對照組對比相差不大。

表2 比較野生株和缺失株對小鼠半數致死量(LD50)的差異

Tab.2 Comparison of difference of LD50of mice infected with the wild and the Δeha

細菌菌落數CFU動物數量AnimalmountThewildMortuus/survival△ehaMortuus/survival1×10988/08/05×10887/16/21×10885/33/55×10783/51/71×10782/60/85×10681/70/81×10680/80/8Total5626/3018/38LD504.64×1071.27×108

圖1 比較E.tarda野生株和缺失株在小鼠肝脾腎中存活數的差異

Fig.1 Comparison of differences between the survival viabilities of the wild ofE.tardain the liver, spleen and kidney of mice and ones of the ΔehaofE.tarda

2.4 比較野生株和缺失株感染小鼠(腹腔注射)后，對小鼠組織的病理損傷的差異。其中細菌感染1 d后，光學顯微鏡下肝臟、脾臟和腎臟的病理變化最明顯(圖2)：野生株感染肝臟的病理改變，主要是以中性粒細胞浸潤為主的炎性反應,出現肝細胞水腫(2B)，脾小體內細胞壞死(2E)，腎小管水腫(2H)等病變，提示野生株對小鼠的肝臟，脾臟和腎臟有一定的毒性作用。而缺失株對肝臟(2C)，脾臟(2F)和腎臟(2I)無明顯毒性作用,與空白組肝臟(2A)，脾臟(2D)和腎臟(2G)相同。這說明eha基因缺失以后,E.tarda菌的毒力明顯減弱,對宿主的病理損傷減輕。

2.5 RT-PCR顯示eha基因對毒力基因的調控作用 如圖3所示，缺失株Δeha中外膜蛋白基因(pagC)和Ⅲ型分泌系統分泌蛋白基因C (eseC)的轉錄水平比野生株明顯降低，互補株ehaComp中這些基因的轉錄水平處于野生株和缺失株之間。菌毛蛋白基因(fimA)在3個菌株中轉錄水平無明顯差異(圖3)，結果提示eha基因對外膜蛋白基因pagC和Ⅲ型分泌系統分泌蛋白eseC有正調控作用。

3 討 論

細菌的調控系統被認為參與細菌生理和毒力的調控網絡中, 它可以調控許多毒力相關基因的表達,進而影響致病菌的毒力。大多數調控系統是二元信號轉導系統如E.tarda的雙組分系統PhoP-PhoQ和EsrA-EsrB[5]，是由一個跨膜感受器蛋白(sensor protein,SP)和應答調節蛋白(response regulator protein, RRP)組成，而有些反應調節因子是一個SP和RRP雜合蛋白，獨自響應宿主環境的變化來進行調控，因此稱其為“獨立”的反應調節因子[6]，Eha就是這樣一個重要的轉錄調控因子。

圖2 比較野生株和eha缺失株感染小鼠1d后肝臟、脾臟、腎臟的病理損傷

Fig.2 Comparison of difference between pathological damage of the liver, spleen and kidney of mice infected by the wild and ones infected by the Δehaafter 1 day

圖3 比較野生株和eha缺失株外膜蛋白基因C、菌毛蛋白基因A和Ⅲ型分泌系統分泌蛋白C轉錄水平的差異

Fig.3 Comparison of difference between the transcriptional levels ofpagC,fimA andeseCof the wild ofE.tardaand ones of the ΔehaofE.tarda

高大慶等[2]用鳥槍法從Et菌的染色體中克隆到一個溶血相關基因,其克隆子在綿羊血平板上有狹窄的β溶血環, 命名為溶血活化基因(GenBank登錄號為:29533)。eha基因進行測序，并BLAST比對發現，eha基因和腸桿菌科中MarR/SlyA調控因子家族中的slyA調控基因[7]有68%的同源性。關于slyA已有較多研究，它在S.typhimurium中可以上調Ⅲ型分泌系統(T3SS)[8]、耐酸蛋白和細胞溶素，下調一些生物合成酶，并被證實參與細菌毒力和環境適應方面。病原菌的Ⅲ型分泌系統(T3SS)擁有一個針狀的結構，能夠將細菌合成的毒力效應蛋白直接輸送到宿主細胞基質中，改變宿主細胞的功能。Ⅲ型分泌系統和外膜蛋白PagC都是沙門菌重要的毒力因子，有利于S.typhimurium在鼠腹腔巨噬細胞內生存和繁殖[9-10]。前期的研究表明Eha蛋白是E.tarda菌一個重要的轉錄調控因子[4]。本實驗用E.tarda感染小鼠的毒力實驗(LD50)結果表明，eha基因正調控細菌毒力。不僅影響細菌ET-13毒力株在小鼠體內存活能力，而且影響細菌對宿主病理的損傷。進一步采用RT-PCR證明eha基因正調控E.tarda的某些重要的毒力因子，如Ⅲ型分泌系統和外膜蛋白PagC，是一個毒力正調控基因。

[1]Chen AP, Jiang YL, Qian D, et al. Edwardsiellasis[J]. China Fisheries, 2011, 7: 49-50. (in Chinese) 陳愛平,江育林,錢冬等. 遲緩愛德華氏菌病[J].中國水產,2011,7:49-50.

[2]Gao D, Kan B, Lu CP, et al. Primary analysis and sequencing the hemolytic relative gene ofEdwardsiellatarda[J]. J Genetics Genomics, 2001, 25(12): 1162-1167. (in Chinese) 高大慶,闞飆,陸承平,等.遲緩愛德華菌溶血相關基因的測序和初步的功能分析[J].遺傳學報,2001.25(12):1162-1167.

[3]Zheng EJ, Gao DQ, Hong J, et al. eha, a regulating virulence gene ofEdwardsiellatarda[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(11): 999-1003. (in Chinese) 鄭恩金,高大慶,洪捷,等.eha,遲緩愛德華菌一個毒力調控基因[J].中國人獸共患病學報, 2010,26(11): 999-1003.

[4]Gao D, Cheng J, Zheng E, et al. Eha, a transcriptional regulator of hemolytic activity ofEdwardsiellatarda[J]. FEMS Microbiol Lett, 2014, 353(2): 132-140. DOI: 10.1111/1574-6968.12420

[5]Lv Y, Xiao J, Liu Q, et al. Systematic mutation analysis of two-component signal transduction systems reveals EsrA-EsrB and PhoP-PhoQ as the major virulence regulators inEdwardsiellatarda[J]. Vet Microbiol, 2012, 157(1/2): 190-199. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.12.018

[6]Kato H, Chibazakura T, Yoshikawa H. NblR is a novel one-component response regulator in the cyanobacteriumSynechococcuselongatusPCC 7942[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72(4): 1072-1079.

[7]Dolan KT, Duguid EM, He C. Crystal structures of SlyA protein, a master virulence regulator of Salmonella, in free and DNA-bound states[J].J Biol Chem, 2011, 286(25): 22178-22185. DOI: 10.1074/jbc.M111.245258

[8]Linehan SA, Rytkonen A, Yu XJ, et al. SlyA regulates function ofSalmonellapathogenicity island 2 (SPI-2) and expression of SPI-2-associated genes[J]. Infect Immun, 2005, 73(7): 4354-4362.

[9]Nishio M, Okada N, Miki T,et al. Identification of the outer-membrane protein PagC required for the serum resistance phenotype inSalmonellaenteric serovar Choleraesuis[J]. Microbiology, 2005, 151: 863-873.

[10]Figueira R, WatsonKG, Holden DW, et al. Identification of salmonella pathogenicity island type III secretion system effectors involved in intramacrophage replication of S. enterica serovar typhimurium: implications for rational vaccine design[J]. MBio, 2013, 4(2) eooo65. DOI:10.1128/mBio.00065-13

ehagene regulates the virulence ofEdwardsiellatarda

SHENG An-kang1,LI Yu-hong1,ZHANG Po1,ZHU Ru-yuan1,DIAO Yi-fei1,ZHOU Jia-ying1,GAO Da-qing1,LU Cheng-ping2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Theehagene is an important transcriptive regulating gene inE.tardavirulence strain ET-13. We explored the gene for regulation of the virulence of ET-13. By comparing the differences between LD50of the wild strain and that of the Δehastrain to mice, the LD50of Δehawas 2.5 times more than that of the wild, which indicated that the virulence of the Δehawas decreased. The numbers of the Δehastrains was significantly lower than those of the wild in a liver, a spleen and a kidney of mice post infection, which indicated that the survival viability of Δehastrains in hostinvivodecreased obviously. In order to compare the host pathological damages caused by the two kinds of strains, these tissues changes infected with the wild and the Δehawere microscopically analyzed. Results showed that the liver cells edema and neutrophil infiltration, spleen cells necrosis and edema of the renal tubules lesions occurred after the mice were infected by the wild, which indicated that the wild was toxic effects to the liver, spleen and kidney, while the Δehawasn’t. Results by RT-PCR showed that the transcriptional levels of T3SS secretion protein gene C (eseC) and OMP gene (pagC) in the Δehawere significantly lower than those in the wild. Results showed that as the lower virulence factors were expressed in the Δeha, the bacterial virulence and host pathological changes were decreased significantly. Therefore,ehagene is a positive regulating gene of the virulence ofE.tarda.

ehagene;E.tarda; virulence

Gao Da-qing, Email: dgao2@yahoo.com

高大慶，Email:dgao2@yahoo.com

1.東南大學醫學院，南京 210009； 2.南京農業大學動物醫學院，南京 210095

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.007

R378

A

1002-2694(2015)02-0125-05

2014-06-26；

2014-10-27

Supported by the SRTP Fund Depended on Teacher Research in Southeast University (No. 1124009015)