常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒方法的建立及其應用

錢明明，許海燕，宗 晴，陰甜甜，楊文彬，宋召軍，黃金林，焦新安

常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒方法的建立及其應用

錢明明1，許海燕2，宗 晴1，陰甜甜1，楊文彬1，宋召軍1，黃金林1，焦新安1

目的 建立GI、GII型諾如病毒的常規RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測方法，并對兩種方法進行應用。方法 優化篩選出最佳PCR反應體系與反應條件，并從靈敏性、特異性、臨床樣品檢測等方面對建立的方法進行比較與評價。結果 該兩種方法特異性強，與札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒同時檢測無交叉反應，同一體系內GI、GII型諾如病毒相互之間沒有干擾；常規RT-PCR最低檢測限為103copies/μL，熒光定量RT-PCR最低檢測限為102copies/μL；對180份臨床糞便樣品進行檢測，常規RT-PCR則檢測率為5.56%(10/180)，符合率達97.22%，熒光定量RT-PCR檢測率為8.33%(15/180)，符合率達100%；對15份陽性樣品測序分析，證實均為諾如病毒。結論 建立的常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR均可用于諾如病毒的快速檢測，熒光定量RT-PCR更為靈敏。

常規RT-PCR；熒光定量RT-PCR；GI、GII型諾如病毒

諾如病毒(Norovirus，NVs)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是引起非細菌性急性胃腸炎的主要病原體，世界50%以上的胃腸炎暴發均由它引起[1]。根據病毒RNA聚合酶和衣殼蛋白核苷酸序列的差異，諾如病毒分為5個基因型，其GI、GII型諾如病毒是世界范圍內最常見的基因型，在全球都有其流行擴散的報道[2-3]，我國病人感染的諾如病毒也是以GI、GII型為主[4]。近年來，國內由諾如病毒引起的急性胃腸炎疫情的報道逐漸增多[5]，日益成為重要的公共衛生問題。因此，建立快速、特異、靈敏的檢測方法對該病的防控具有重要意義。

由于諾如病毒尚不能進行體外培養，也缺乏相應的動物模型，變異多，鑒別和檢測非常困難，傳統的免疫學及血清學檢測方法存在很大的局限性[6]。隨著大量諾如病毒全基因及部分序列的測定與分析，分子生物學技術被廣泛應用于其診斷和研究[7]。本研究建立檢測GI、GII型諾如病毒的常規RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法，并應用于臨床樣品的檢測，對兩種方法進行比較分析，為進一步完善諾如病毒的檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品的采集與處理 180份臨床樣品采集于揚州市人民醫院腹瀉病人的糞便樣品，并用PBS制成10%的糞便懸液，保存于-70℃以備用。

1.2 主要試劑與儀器 TIANamp Virus RNA Kit(TIANGEN公司，貨號：DP315-R)，PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，貨號：RR037A)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，凝膠成像系統(BIO公司)，ABI 7500熒光PCR儀(ABI公司)。

1.3 引物與探針 引物及探針序列如下表[8-9]，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR用的引物與探針

1.4 病毒RNA提取及cDNA合成 用TIANamp Virus RNA Kit提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書；提取的RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進行逆轉錄，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.5 常規RT-PCR方法的建立

1.5.1 PCR體系與條件 采用正交設計來優選最佳PCR反應體系，同時優選最佳退火溫度。優化后的PCR體系為25 μL，其組分為：2.5 μL 10×PCR Buffer，0.5U Taq酶，上、下游引物各1.25 μL，3.0 μL dNTP，3.0 μL cDNA，用滅菌蒸餾水補足到25 μL體積；優化后的反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃最終延伸10 min。

1.5.2 靈敏性、特異性試驗 用分光光度計對陽性GI、GII型諾如病毒樣品提取的RNA進行定量，10倍梯度稀釋病毒液，運用建立的RT-PCR對100～105copies/μL的GI、GII型諾如病毒進行檢測，分析其最低檢測限；同時對GI、GII型諾如病毒、札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒進行檢測，驗證其特異性。

1.6 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 PCR體系與條件 采用矩陣法優選最佳熒光定量PCR反應體系。優化后的PCR體系為20 μL，其組分為：10 μL 2×Premix Ex Taq，0.4 μL 50×Rox Reference DyeⅡ，上、下游引物各1.6 μL，探針0.8 μL，2.0 μL模板cDNA，用RNase free Water補足至20 μL體積；反應條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環；在60 ℃收集熒光信號。

1.6.2 GI、GII型諾如病毒標準曲線的制作 用于制作定量標準曲線的標準品為含有GI、GII型諾如病毒目的擴增片段的質粒，紫光分光光度計測定濃度，并根據質粒分子量及阿佛伽德羅常數換算成拷貝數。將質粒進行倍比稀釋，共稀釋8個梯度，分別為101～108copies/μL，每個梯度分別用熒光PCR進行檢測，反應結束后，通過收集熒光信號的CT值，繪制出相應的標準曲線。

1.6.3 靈敏性、特異性試驗 運用建立的熒光定量RT-PCR對100～105copies/μL的GI、GII型諾如病毒進行檢測，分析其最低檢測限；同時對GI、GII型諾如病毒、札幌病毒、輪狀病毒、星狀病毒、腺病毒進行檢測，驗證其特異性。

1.6.4 重復性試驗 分別選取3個不同稀釋梯度的GI、GII型諾如病毒進行檢測，每個稀釋梯度平行重復5次，1周重復3次，計算各稀釋梯度CT值的平均值、標準差以及變異系數，以評價其批內、批間重復性。

1.7 臨床樣品的檢測 用建立的兩種方法對180份臨床樣品進行檢測，并對其檢測結果進行比較，檢出的陽性樣品進行測序以驗證兩種方法對臨床樣品中諾如病毒的準確檢測能力。

1.8 數據分析 檢出的敏感度、特異度和符合率分別按下列公式進行計算。

敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)

特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)

符合率=(真陽性數+真陰性數)/被檢總數

2 結 果

2.1 常規RT-PCR靈敏性、特異性試驗 靈敏性試驗如圖1所示，105、104、103copies/μL的GI、GII型諾如病毒均擴增出相應的目的條帶，即最低檢測限為103copies/μL。特異性試驗如圖2所示，分別在相應的位置顯示出相應的目的條帶，而其他4株腸道病毒均沒擴增出目的條帶，且GI、GII型諾如病毒也沒交叉反應，說明該方法具有良好的特異性。

2.2 熒光定量RT-PCR標準曲線的建立 如圖3所示，GI、GII型諾如病毒在102～108copies/μL范圍內有極好的線性關系，以起始模板數的對數為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，得到GI型的標準曲線方程為Y=40.585-3.301×logX，R2=0.997，擴增效率100.889%；GII型的標準曲線方程為Y=40.666-3.229×logX，R2=0.996，擴增效率104.039%。

M: DNA marker; 1-6: Norovirus GI (GII) from 105to100copies per reaction; 7: Negative control.

圖1 常規RT-PCR對GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測的靈敏性

Fig.1 Detection limit of conventional RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

M: DNA marker; 1-6: Norovirus GI, Norovirus GII, Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus, Adenovirus; 7: Negative control.

圖2 常規RT-PCR對GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測的特異性

Fig.2 Detection specificity of conventional RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

圖3 GI(A)、GII(B)諾如病毒的標準曲線

2.3 熒光定量RT-PCR靈敏性、特異性試驗 靈敏性試驗如圖4顯示，105、104、103、102copies/μL的GI、GII型諾如病毒均得到相應良好的擴增曲線，即最低檢測限為102copies/μL；特異性試驗如圖5顯示，GI、GII型諾如病毒經熒光定量PCR擴增后，分別有相應的熒光擴增曲線，而其他4株腸道病毒均沒有熒光信號產生，且GI、GII型諾如病毒也沒交叉反應，表明其所用引物和探針具有良好的特異性。

From left to right: 105-100copies/μL for NVs GI and GII and negative control.

圖4 熒光定量RT-PCR對GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測的靈敏性

Fig.4 Detection limit of real-time RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

From left to right: Norovirus GI, Norovirus GII, Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus, Adenovirus, negative control.

圖5 熒光定量RT-PCR對GI(A)、GII(B)型諾如病毒檢測的特異性

Fig.5 Detection specificity of real-time RT-PCR for NVs GI(A) and GII(B)

2.4 熒光定量RT-PCR重復性試驗 結果見表2，同一批次內GI、GII型諾如病毒標準差在0.040～0.137范圍內，變異系數在0.18%～0.57%之間；不同批次間GI、GII型諾如病毒標準差在0.138～0.675范圍內，變異系數在0.71%～2.62%之間，由此證明此方法具有良好的批內、批間重復性。

表2 熒光定量RT-PCR檢測GI、GII型諾如病毒的重復性

2.6 常規RT-PCR法與熒光定量RT-PCR對臨床樣品的檢測及比較 180份臨床樣品中，常規RT-PCR檢測率為5.56%(10/180)，熒光定量RT-PCR檢測率為8.33%(15/180)，經統計學分析，兩種方法的檢測率有顯著差異(P<0.05)；計算可知，常規RT-PCR敏感度、特異度分別為66.67%、97.06%，符合率達到97.22%；而熒光定量RT-PCR敏感度、特異度和符合率均達到100%(見表3)；對陽性樣品進行測序，結果證實均為諾如病毒。

3 討 論

諾如病毒是引起人類非細菌性胃腸炎的重要病原體，主要通過污染的食物和水源傳播，侵染力強，感染劑量可低至10～100病毒粒子，傳播迅速，極易引起暴發。因此對該病毒進行快速、準確的定性、定量監測，對預防疫情暴發具有重要的意義。

目前，檢測諾如病毒的方法有電鏡法、免疫法和分子生物學等方法，電鏡法是最早的檢測方法，但靈敏度低，而且樣品處理過程復雜、技術要求高，不利于臨床應用。免疫法應用比較多的是酶聯免疫法，雖快速靈敏，但假陽性率高，檢出率低。而以RT-PCR為主的分子生物學檢測方法因準確、快速、特異性好、靈敏度高而被廣泛應用。由于諾如病毒極易發生變異，存在型別眾多，其中引起人類感染的GI、GII型諾如病毒至少可分為14和17個基因亞型[10]，因此引物設計是RT-PCR檢測諾如病毒的關鍵因素。有研究對目前國內外常規RT-PCR檢測諾如病毒中應用的8對引物進行比較，發現Kojima等[8]針對諾如病毒衣殼蛋白保守區的基因序列設計的引物GI-SKF/GI-SKR、GII-SKF/GII-SKR是檢測諾如病毒的理想引物。此外，近年發展起來的熒光定量RT-PCR技術不僅能完成定性檢測，還可進行定量分析，逐步成為病毒檢測的常用方法。Kageyama等[9]針對諾如病毒ORF1-ORF2連接處的高度保守區的基因序列設計引物COG1F/COG1R、COG2F/COG2R和探針，對于電鏡觀察為陽性諾如病毒的樣品，該引物的檢測靈敏度高達99%，是目前文獻報道靈敏度較高的引物。

表3 常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測結果的比較

本研究建立的常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR方法均具有良好的特異性，常規RT-PCR檢測限為103copies/μL，熒光定量RT-PCR比其靈敏10倍。有研究認為采用一步法熒光定量RT-PCR，省去體外逆轉錄步驟，可大大提高其檢測效率。本研究建立的二步法熒光定量RT-PCR，其靈敏性與王毅謙等[11]利用Allglo探針建立的一步法雙重熒光RT-PCR相當，比周冬梅等[12]建立的二步法雙重熒光RT-PCR高1個數量級。運用建立的兩種方法對180份臨床樣品進行同步檢測，常規RT-PCR檢出率為5.56%，熒光定量RT-PCR檢出率為8.33%，統計分析后者檢出率顯著高于前者(P<0.05)，對檢出的陽性樣品進行測序，結果均為諾如病毒，表明該兩種方法均具有準確的檢測能力。并且常規RT-PCR方法的敏感度、特異度分別為66.67%、97.06%，符合率達到97.22%，而熒光定量RT-PCR方法的敏感度、特異度、檢測率要高于常規RT-PCR，均可達到100%。此外，對于熒光定量RT-PCR檢測CT值在30以內的陽性樣品，常規RT-PCR的檢出率為100%，當CT值大于30的陽性樣品時，常規RT-PCR未能檢測出，表明常規RT-PCR對病毒量大的臨床樣品能有效地進行檢測，但熒光定量RT-PCR敏感性更高，對于諾如病毒的檢測，建議首選熒光定量RT-PCR，以免發生漏檢的情況。

本研究建立的諾如病毒常規RT-PCR和熒光定量RT- PCR檢測方法，具有良好的靈敏性、特異性和重復性，且能快速區分GI、GII兩種感染人類的重要型別，對諾如病毒感染的快速分型有著實際意義。其中熒光定量RT-PCR方法不僅能定性檢測諾如病毒，還能定量分析，這對于致病劑量和風險評估的后期研究有著重要的意義。省去體外逆轉錄過程，實現一步法熒光定量RT-PCR，是否更能提高本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測靈敏度，有待進一步驗證。

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Establishment of conventional RT-PCR and real-time RT-PCR to detect norovirus and its application

QIAN Ming-ming1,XU Hai-yan2,ZONG Qing1,YIN Tian-tian1,YANG Wen-bin1,SONG Zhao-jun1,HUANG Jin-lin1,JIAO Xin-an1

(1.KeyLaboratoryofZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.NantongCenterforDiseaseControlandPrevention,Nantong226000,China)

We established conventional RT-PCR and real-time RT-PCR methods for the detection of norovirus GI and GII. The PCR system and reaction conditions were optimized so that conventional RT-PCR and real-time RT-PCR method were established, the sensitivity, specificity and the detection of clinical stool specimens of these two methods were compared and evaluated. Results showed that the two methods possessed high specificity for norovirus, without any evident cross-reaction with each other or with other enteric viruses, including Sapporovirus, Rotavirus, Stellatevirus and Adenovirus; the detection limit of conventional RT-PCR was 103copies/μL, while the detection limit of real-time RT-PCR was 102copies/μL; the two methods were detected of 180 clinical stool specimens for norovirus; the positive rate for conventional RT-PCR was 5.56% (10/180), the coincidence rate was 97.22%; the positive rate for real-time RT-PCR was 8.33% (15/180), and the coincidence rate was 100%; 15 positive samples were conducted the sequencing analysis and it was confirmed that all of them were norovirus. The two methods were established in this study, which were used in the rapid detection of norovirus, while real-time RT-PCR was more sensitive than conventional RT-PCR.

conventional RT-PCR; real-time RT-PCR; norovirus GI and GII

Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn

黃金林，Email:Jinlin@yzu.edu.cn

1.揚州大學人畜共患病重點實驗室，揚州 225009； 2.南通市疾病預防控制中心，南通 226000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.002

R450

A

1002-2694(2015)07-0602-05

2014-11-05；

2015-05-10

國家“863計劃”(2012AA101601)

Supported by the National Programs for High Technology Research and Development of China (No. 2012AA101601)