高表達OAZI-1 的小鼠黑色素瘤B16-F1 細胞能有效活化小鼠抗原提呈細胞①

楊建林 李 倩 韓 鈺 何 玲 吳紅艷 曹春雨 王艷林

(三峽大學分子生物學研究所，宜昌 443002)

多胺是廣泛存在于生物組織中的一類帶多價正電荷的脂肪族小分子化合物，高多胺含量是腫瘤快速生長所必需的條件之一［1］。鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的限速酶，其活性對調節細胞內多胺水平起重要作用。細胞內同時存在一種ODC 抑制蛋白，即鳥氨酸脫羧酶抗酶(Ornithine decarboxylase antizyme，OAZ)，新近研究發現，OAZ 活性本身又受另一蛋白因子即鳥氨酸脫羧酶抗酶抑制因子(Ornithine decarboxylase antizyme inhibitor，OAZI)的抑制，上述三者共同構成ODC 活性調節的反饋環［2］。在OAZI 蛋白家族中，OAZI-1是發揮調控作用的主要成員，它在蛋白水平上競爭性結合OAZ，釋放ODC/OAZ 復合物中的ODC 并使后者活化，從而影響多胺代謝［3］。本研究的前期工作發現，高表達OAZI-1 對黑色素瘤B16-F1 細胞在接種小鼠皮下成瘤有顯著性抑制作用，同時接種小鼠體內產生對再次接種的同種腫瘤細胞的免疫殺傷活性，提示高表達OAZI-1 可能增加了腫瘤細胞的免疫原性。巨噬細胞(Macrophage，M)和樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)是機體內功能強大的抗原提呈細胞，巨噬細胞和未成熟的DC 具有攝取和加工抗原的功能，而成熟的DC 則能有效激活效應T 細胞，誘導機體免疫應答發生。本研究中，我們在細胞水平上分析了小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠骨髓來源的DC對高表達OAZI-1 的B16-F1 腫瘤細胞的吞噬作用，同時檢測了上述吞噬過程中對DC 成熟的促進作用，以及DC 被刺激成熟后能夠有效活化T 細胞的效率，由此驗證小鼠B16-F1 細胞在表達OAZI-1 后，能否更有效地被免疫吞噬細胞所吞噬，并活化DC從而遞呈抗原，有效激活機體抗腫瘤免疫應答。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和實驗動物 真核表達載體pCNDA3.1(+)和pCNDA3.1(+)-OAZI-1 由本研究小組構建、保存;小鼠黑色素瘤B16-F1 細胞從中國培養物典藏中心(武漢)購買;LipofectamineTM2000 轉染試劑、TRIzol RNA 純化試劑為Invitrogen 公司產品;預染標準分子量蛋白Marker-441、dNTP、RT-PCR及PCR 試劑盒為Fermentas 公司產品;抗β-actin 單克隆抗體為Santa Cruz 公司產品;兔抗鼠OAZI-1 多克隆抗體為Proteintech Group 公司產品;辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG-HRP 為Jackson 公司產品;RPMI1640 細胞培養基、胎牛血清、小牛血清、胰酶、DMSO 等均為Gibco 公司產品;各種熒光標記抗體(PE 標記的抗小鼠CD11C 抗體、PE 標記的抗小鼠CD11b 抗體、PE 標記的抗小鼠CD40 抗體、PE 標記的抗小鼠CD80 抗體、PE 標記的抗小鼠CD86 抗體)均為eBioscence 公司產品;重組小鼠GM-CSF 細胞因子、重組小鼠IL-4 和重組小鼠IL-2 細胞因子為Peprotech 公司產品;BALB/c 小鼠，雌性，4～6 周齡，質量(18 ±2)g 購自三峽大學實驗動物中心。

1.2 細胞培養、質粒轉染及高表達細胞株篩選 用含10%小牛血清的RPMI1640 培養基常規方法培養小鼠黑色素瘤B16-F1 細胞。用脂質體LipofectamineTM2000 法分別將pcNDA3.1(+)-OAZI-1 和對照質粒pcNDA3.1(+)轉染至對數生長期細胞內，隨后用400 mg/ml G418 篩選陽性克隆，將篩選出的陽性克隆細胞株擴大培養后收集細胞，TRIzol 試劑法提取RNA，M-mlV 反轉錄酶將mRNA 反轉錄為cDNA，以此cDNA 為模板，通過PCR 反應鑒定細胞中OAZI-1 基因的表達水平。OAZI-1 引物序列為5'-GAAGTTTGGCACTACACTGAAG-3'(正向)和5'-CCACCGATGTCTAACATGTTC-3'(反向);該實驗以β-actin 作為內參照。另收集陽性克隆細胞并用細胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100)裂解，由此獲得的細胞總蛋白經10% SDS-PAGE 分離，電轉移至PVDF 膜上。隨后PVDF 膜用TBST(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)配制的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，兔抗鼠OAZI-1 抗體(1∶2 000)4℃條件下孵育過夜，和羊抗兔IgG-HRP(1∶ 5 000)作用2 h，電化學發光法示蹤OAZI-1 蛋白的表達水平。將通過上述方法獲得的高表達OAZI-1 的B16-F1 細胞克隆株命名為B16/OAZI-1 細胞，轉染空載質粒pcDNA3.1(+)的B16-F1 細胞株命名為B16/3.1 細胞。

1.3 制備BALB/c 小鼠腹腔巨噬細胞 每只小鼠腹腔注射1%無菌淀粉溶液1 ml，24 h 后頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射5 ml PBS，輕揉小鼠腹部后，收集沖洗腹腔的PBS，1 000 r/min 離心10 min，棄去上清，即得到小鼠腹腔巨噬細胞。

1.4 制備BALB/c 小鼠脾臟淋巴細胞 小鼠無菌剪開腹腔，取出脾臟，在無血清RPMI1640 培養液中經過鋼網研磨，200 目尼龍網過濾，獲得小鼠脾細胞懸液，小心加入3 ml 淋巴細胞分離液中，2 000 r/min 離心20 min，吸取中間懸浮的白色淋巴細胞，PBS 洗滌兩次后加入細胞培養液，即得到小鼠脾臟淋巴細胞。

1.5 制備BALB/c 小鼠骨髓來源的DC 細胞 將小鼠頸椎脫臼法處死，無菌狀態下取出脛骨和股骨，剪開骨頭兩端，用1 ml 注射器吸取無血清RPMI1640 培養液，沖洗骨髓腔，收集沖洗出的骨髓細胞懸液，1 500 r/min 離心10 min。棄上清，利用紅細胞裂解液裂解紅細胞后，PBS 洗滌1 次。將獲得的細胞用含10%胎牛血清、10 ng/ml 重組小鼠GM-CSF、10 ng/ml重組小鼠IL-4 的RPMI1640 培養基重懸，在細胞培養皿中置于37℃，含5%CO2的細胞培養箱內培養。48 h 后棄去尚未貼壁的細胞，僅保留貼壁的DC 前體細胞繼續培養。隨后，每48 h 半量換液，共培養168 h。收集培養細胞，即為富集的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell，BMDC)。

1.6 流式細胞術檢測巨噬細胞和DC 對腫瘤細胞的吞噬效應 本實驗將B16/OAZI-1 細胞和B16/3.1 細胞用作靶細胞，將巨噬細胞和DC 用作效應細胞。靶細胞用5 μmol/L 的綠色熒光染料CFDA-SE于37 ℃細胞培養箱孵育染色30 min，PBS 洗滌2次，取5 ×105個靶細胞與2.5 ×106個巨噬細胞(靶效比為5∶1)或5 ×105個DC(靶效比為1∶1)混合培養4 h 后，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml PBS重懸細胞，然后用5 μl PE-CD11b 抗體標記巨噬細胞，5 μl PE-CD11c 抗體標記DC，避光37℃反應30 min。PBS 洗滌2 次后，1 ml PBS 重懸細胞，流式細胞儀分析細胞吞噬效率。

1.7 流式細胞術檢測成熟DC 表面特征性分子表達 分別取B16/OAZI-1 細胞和B16/3.1 細胞各5×105個與5 ×105個DC 細胞(效靶比為1∶1)混合培養24 h 后，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml PBS 重懸細胞，分別用抗小鼠PE-CD40 抗體，PECD80 抗體和PE-CD86 抗體避光37℃孵育細胞30 min，PBS 洗滌細胞3 次，1 ml PBS 重懸細胞，流式細胞術分析DC 表面分子的表達。

1.8 ELISA 檢測體細胞培養上清中IFN-γ 含量 分別將B16/OAZI-1 細胞和B16/3.1 細胞與BALB/c小鼠骨髓來源的未成熟DC 按照1∶1的細胞數量比混合后共孵育培養48 h，隨后將共孵育細胞加入同樣來自BALB/c 小鼠的脾淋巴細胞中，并加入終濃度為200 U/ml 的小鼠IL-2 細胞因子，繼續混合培養24 h，收集細胞培養液上清，用ELISA 法檢測細胞培養上清中IFN-γ 的含量。

1.9 統計學處理 實驗數據用SPSS18.0 統計軟件處理，所有計量資料以±s 表示，采用t 檢驗，以P＜0.05 為顯著性差異。

2 結果

2.1 獲得穩定高表達OAZI-1 的B16-F1 細胞克隆株 將質粒pcNDA3.1(+)-OAZI-1 轉染B16-F1 瘤細胞后，經G418 篩選得到成功轉染的陽性細胞克隆株(B16/OAZI-1)。擴大培養后，用RT-PCR 和Western blot 技術從mRNA 和蛋白表達水平證實該細胞株內OAZI-1 高表達(圖1、2)。本實驗以成功轉染空白質粒pcNDA3.1(+)的細胞(B16/3.1)作為對照。

圖1 逆轉錄PCR 法篩選穩定高表達OAZI-1 的B16-F1細胞株Fig.1 Selection of B16-F1 cell line with stable OAZI-1 over-expression by RT-PCR

圖2 免疫印跡法篩選穩定高表達OAZI-1 的B16-F1 細胞株Fig.2 Selection of B16-F1 cells with stable OAZI-1 overexpression by Western blot

2.2 高表達OAZI-1 的細胞能更高效地被吞噬細胞所吞噬 CD11b 和CD11c 分別為巨噬細胞和DC 細胞的表面分子標志物，本實驗首先分析了PE 標記的CD11b 和CD11c 抗體分別與上述細胞結合的能力，經流式細胞儀檢測發現，90%以上細胞被標記。同時，我們采用熒光染料CFDA-SE 標記B16/OAZI-1細胞和B16/3.1 細胞，經流式細胞儀驗證，標記效率也在90%以上(圖3)。將標記的小鼠腹腔巨噬細胞和DC 作為效應細胞，分別與標記的B16/OAZI-1 細胞和B16/3.1 細胞混合培養4 h，由于靶細胞和效應細胞分別用不同熒光探針標記，在流式細胞儀中檢測到的雙熒光陽性細胞即為吞噬了腫瘤細胞的效應細胞。結果顯示巨噬細胞和DC 對B16/OAZI-1 細胞的吞噬率分別為24.7%和53.9%，與對照B16/3.1 組8.2%和13.8%的吞噬率相比較有顯著性差異(P＜0.05)。上述研究提示，高表達OAZI-1的腫瘤細胞能更有效地被吞噬細胞識別和吞噬(圖4)。

圖3 流式細胞儀檢測細胞熒光標記效率Fig.3 Flow cytometry was used to determine efficiency of cell-labeling by fluorescent probes

圖4 OAZI 高表達增強巨噬細胞和DC 對靶細胞的吞噬作用Fig.4 High expression of OAZI enhanced phagocytosis of target-cells by Mφ and DC in vitro

圖5 OAZI 高表達促進DC 活化成熟Fig.5 High expression of OAZI on target-cell promoted DC maturation

圖6 B16/OAZI-1 活化的DC 誘導T 細胞分泌IFN-γFig.6 B16/OAZI-1 activated DC induced secretion of IFN-γ by T lymphatic cells

2.3 高表達OAZI-1 的腫瘤細胞促進DC 活化成熟CD40、CD80、CD86 是成熟DC 的標志性表面分子，本實驗中，我們首先將B16/OAZI-1 和B16/3.1分別與DC 共孵育，染后用PE 標記的抗小鼠CD40、CD80、CD86 抗體分別對DC 細胞進行標記，并用流式細胞儀檢測DC 表面這些分子的表達情況。結果顯示(圖5)，與對照組B16/3.1 細胞相比，DC 與B16/OAZI 細胞混合培養24 h 后，CD40、CD80 和CD86 表達陽性的細胞分別從24.2%、20.8% 和16.4%增加到46.8%、32.5%和36.1%，統計學分析差異具有顯著性(P＜0.05)，提示，B16/OAZI-1細胞能更有效地誘導DC 成熟。

2.4 B16/OAZI-1 活化的DC 誘導T 細胞分泌IFN-γ 成熟DC 在向效應T 細胞提呈抗原過程中將激活效應T 細胞，活化T 細胞的主要特征之一是大量合成和分泌IFN-γ。本研究中，我們將與B16/OAZI-1 細胞共孵育后的DC 與小鼠脾淋巴細胞混合培養24 h，然后用ELISA 檢測細胞培養上清液中IFN-γ 的含量，結果表明(圖6)，與B16/OAZI 細胞共孵育后的DC 與小鼠脾淋巴細胞混合培養后，細胞培養上清液中IFN-γ 含量為32.9 pg/ml，顯著性高于B16/3.1 對照組(15.1 pg/ml)，說明B16/OAZI-1 細胞活化的DC 能更有效遞呈腫瘤抗原和誘導T 細胞活化。

3 討論

腫瘤的發生和發展與腫瘤細胞的免疫逃逸現象密切相關，近年研究發現通過增加腫瘤細胞表面鈣網蛋白(Calreticulin，CRT)表達或改變腫瘤微環境，可促使腫瘤細胞發生免疫原性轉化，誘導機體產生有效的抗腫瘤免疫應答。上述研究為腫瘤預防和治療提供了新的途徑［4-7］。本課題的前期研究發現，高表達OAZI-1 對黑色素瘤B16-F1 細胞在接種小鼠皮下成瘤有顯著性抑制作用，并能誘導小鼠體內產生抗同種腫瘤的免疫效應，提示高表達OAZI-1 可能使腫瘤細胞發生免疫原性轉化(另文發表)。以往研究已證實，多胺代謝途徑與腫瘤的發生發展有密切的關系，腫瘤細胞中高多胺含量是決定腫瘤快速生長的因素之一，但尚無文獻報道多胺代謝與抗腫瘤免疫之間的關系，本文從細胞水平上對高表達OAZI-1 的B16-F1 細胞是否發生了免疫原性轉化進行了進一步研究。

DC 是重要的專職抗原遞呈細胞，巨噬細胞在機體免疫應答過程中也發揮重要的抗原遞呈作用。因此，B16/OAZI-1 細胞如果發生了免疫原性轉化，首先會被巨噬細胞、DC 等抗原遞呈細胞有效識別、吞噬，由此誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫應答。本研究中，我們以高表達OAZI-1 的小鼠黑色素瘤B16-F1 腫瘤細胞(B16/OAZI-1)為靶細胞，以小鼠腹腔巨噬細胞和小鼠骨髓來源的DC 為效應細胞，將上述兩種細胞共孵育后，觀察效應細胞對靶細胞的吞噬作用。結果顯示，與對照組B16/3.1 細胞相比較，腹腔巨噬細胞和DC 對B16/OAZI-1 細胞的吞噬率均有顯著性增高，提示高表達OAZI-1 的B16-F1 細胞能更有效地被抗原提呈細胞吞噬。

DC 對腫瘤細胞的識別和吞噬是腫瘤細胞免疫原性轉化的關鍵環節，DC 細胞的活化、成熟以及腫瘤抗原加工和呈遞將隨之進行。因此在體外試驗中，我們進一步分析了B16/OAZI-1 能否促進DC 活化與成熟。實驗中檢測了3 種成熟的DC 細胞表面分子標志物CD40、CD80、CD86 的表達量，結果顯示DC 與B16/OAZI-1 細胞混合培養后，上述3 種表面分子標志物的表達有一定程度的增加，與B16/3.1細胞對比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示OAZI-1 在B16-F1 細胞中高表達具有促進DC 成熟和活化的作用。

DC 細胞將吞噬的腫瘤抗原加工并遞呈給CD4+的T 淋巴細胞，由此導致T 淋巴細胞活化，活化的T淋巴細胞的重要特征之一是大量合成和分泌IFN-γ等細胞因子，IFN-γ 等通過調節細胞毒T 細胞以及免疫系統的多個環節而激活細胞免疫系統，誘導機體抗腫瘤免疫應答的發生。本實驗中，我們首先將腫瘤細胞和DC 混合孵育，隨后將上述混合細胞與小鼠脾淋巴細胞共培養，并通過檢測細胞培養上清中IFN-γ 的含量，判斷小鼠T 淋巴細胞體外活化的情況。結果顯示，B16/OAZI-1 細胞實驗組中IFN-γ含量顯著性高于B16/3.1 對照細胞組，兩組結果差異具有顯著性(P＜0.05)。上述研究提示，在體外由B16/OAZI-1 活化成熟的DC 能將腫瘤抗原加工遞呈給T 淋巴細胞，并促使T 淋巴細胞活化和合成分泌IFN-γ。

綜上所述，在體外實驗中，OAZI-1 在小鼠黑色素瘤B16-F1 細胞中高表達能夠促進巨噬細胞和DC等抗原遞呈細胞對B16-F1 細胞的識別和吞噬，這一過程可有效促進DC 細胞的成熟。該種成熟的DC細胞能有效將腫瘤抗原遞呈給T 淋巴細胞，誘導T淋巴細胞活化，從而激活機體抗腫瘤免疫應答。本實驗結果在細胞水平上進一步提示，OAZI-1 高表達能促進B16-F1 細胞發生免疫原性轉化。但有關OAZI-1 高表達促進腫瘤細胞發生免疫原性轉化的分子機制尚未完全闡明，有待進一步深入研究。

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