金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-1/TIMP-1 表達(dá)影響①

王曉倩 李 鑫 郭建生 朱克儉

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty arthritis，GA)是一種由于體內(nèi)嘌呤代謝異常，使尿酸鈉在關(guān)節(jié)腔內(nèi)沉積形成結(jié)晶，造成關(guān)節(jié)腫脹、變形的結(jié)晶性關(guān)節(jié)炎［1］。隨著居民大量的攝食蛋白質(zhì)及富含嘌呤成分的食物，痛風(fēng)已成為影響我國(guó)人口健康的重大代謝性疾病之一，引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)切［2］。

研究認(rèn)為，痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制主要為血液中尿酸含量升高，達(dá)到飽和狀態(tài)形成尿酸鈉微結(jié)晶。當(dāng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的尿酸鹽結(jié)晶被白細(xì)胞吞噬后，沉積并刺激關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及關(guān)節(jié)周?chē)M織，釋放出組胺、趨化因子及相關(guān)前炎癥因子等物質(zhì)，使調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinases，MMP-1)高表達(dá)，導(dǎo)致MMP-1/TIMP-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-1，組織金屬蛋白酶抑制劑-1)失衡，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生病理性改變［3］，導(dǎo)致局部血管擴(kuò)張、白細(xì)胞大量聚集，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)［4］，形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［5］。

目前臨床治療痛風(fēng)以緩解癥狀為主，多使用秋水仙堿、吲哚美辛等非甾體類(lèi)化學(xué)藥品。然而上述藥物的使用并不能延緩病情發(fā)展，且存在腹瀉、血小板減少等副作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)以脾、腎虧虛為本，痰瘀、濕熱為標(biāo)，痰瘀為病之變，濕熱為病之現(xiàn)［6］。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)不僅療效確切，且安全性高。本課題組擬研發(fā)治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的創(chuàng)新中藥——金鳳顆粒，該藥由萆薢、鳳尾草、艾葉、金錢(qián)草等組成。前期研究顯示，金鳳顆粒能顯著降低氧嗪酸鉀鹽所致高尿酸血癥小鼠的尿酸水平［7］，能有效抑制TNF-α、IL-8、IFN-γ 等促炎性因子釋放［8］。本研究擬建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)兔模型，研究金鳳顆粒對(duì)關(guān)節(jié)病理?yè)p傷及關(guān)節(jié)軟骨MMP-1/TIMP-1 的影響，進(jìn)而明確其治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為其臨床治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)實(shí)證依據(jù)。

在開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)研究工作前均簽署動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查書(shū)，且所有工作的進(jìn)行均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的相關(guān)要求及所有規(guī)定。

1 材料與方法

1.1 試藥及試劑

1.1.1 受試藥物 金鳳顆粒(No.140301)，湖南省中醫(yī)藥研究院;腺嘌呤(No.0183)，英國(guó)Amresco 公司;尿酸鈉(No.U2875)，美國(guó)Sigma 公司;鹽酸乙胺丁醇片(No.1304041)，沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司;別嘌醇片(No.20140108)，廣東彼迪藥業(yè)有限公司;痛風(fēng)定膠囊(No.1405112)，四川升和藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 試劑 兔抗人MMP-1(No.BA0568)、TIMP-1(No.BA0575)多克隆抗體，SABC 免疫組化染色試劑盒(No.SA1022)，DAB 顯色試劑盒(No.AR10 22)，武漢博士德生物工程有限公司;甲醛溶液(No.20140204)，天津市百世化工有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭家兔，雄性，體重1.5～2 kg，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證編號(hào):SCXK(湘)2011-0003。

1.2 方法

1.2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔模型建立［9］取新西蘭家兔70 只，按體重進(jìn)行隨機(jī)化分組，分為空白組(10只)和模型組(60 只)。模型組灌服腺嘌呤(200 mg/kg)和乙胺丁醇(250 mg/kg)，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后30 min，將10%MSU 混懸液經(jīng)上髕骨韌帶(關(guān)節(jié)伸直45°，4 號(hào)針頭進(jìn)針，插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè))注射入兔右踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔，0.3 ml/只，復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.2 分組及給藥 模型成功后，按體重進(jìn)行隨機(jī)化分組，分為模型組、金鳳顆粒高、中、低劑量組(19.6、9.8、4.9 g/kg)、別嘌醇組(0.028 g/kg)及痛風(fēng)定組(0.448 g/kg)。各組分別給予相應(yīng)藥液，模型組、空白組給予等容積蒸餾水，ig 給藥，8 ml/kg，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響 末次給藥24 h 后，麻醉家兔，取關(guān)節(jié)軟骨組織，10 %甲醛溶液固定，將軟骨病理標(biāo)本做成蠟塊，間斷連續(xù)切片，切片厚約5 μm，HE 染色，采用盲法實(shí)驗(yàn)原則，選用未知分組人員觀察其病理形態(tài)學(xué)的改變，并評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1［10］。

1.2.4 金鳳顆粒對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎家兔關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、TIMP-1 表達(dá)的影響 末次給藥2 h 后，麻醉家兔，取關(guān)節(jié)軟骨組織，于10%甲醛溶液固定，行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP(鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)法檢測(cè)。每張切片選取5 個(gè)典型區(qū)域拍攝數(shù)碼圖像，使用圖像分析軟件分析各組照片的單位光密度值并進(jìn)行比較，根據(jù)光密度值的大小判斷各指標(biāo)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0 軟件分析，數(shù)據(jù)用±s 表示。組間比較，計(jì)量資料首先做正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性，采用Oneway ANOVA 進(jìn)行方差分析，不滿足方差齊性采用非參數(shù)法檢驗(yàn)。P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Histological classification criteria of synovial histologic change

2 結(jié)果

2.1 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的影響 空白組關(guān)節(jié)軟骨面完整，未見(jiàn)有血管充血、黏膜腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及組織壞死，也未見(jiàn)有絨毛狀增生和血管翳形成。模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)紊亂，有血管充血及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分樣本關(guān)節(jié)軟骨組織壞死，與空白組比較，評(píng)分有顯著性差異(P＜0.01)，提示模型復(fù)制成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后，各劑量組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織血管充血、黏膜腫脹、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、組織壞死情況均有顯著的改善，差異具有顯著性(P＜0.05 或P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2 及圖1。

2.2 金鳳顆粒對(duì)家兔軟骨組織MMP-1、TIMP-1 表達(dá)影響 與空白組相比，模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1 表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)、TIMP-1 表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，提示模型建立成功。經(jīng)金鳳顆粒治療后，與模型組相比，高劑量組MMP-1 表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，TIMP-1 表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。中劑量組MMP-1 的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3，圖2、3。

表2 關(guān)節(jié)軟骨改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

表2 關(guān)節(jié)軟骨改變的組織學(xué)分級(jí)評(píng)分結(jié)果(±s，n=10)Tab.2 Results of grading histological change of articular cartilage tissue(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

表3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

表3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1、TIMP-1 及MMP-1/TIMP-1 影響(±s，n=10)Tab.3 Effect of Jinfeng granules on MMP-1，TIMP-1 and MMP-1/TIMP-1 in rabbit articular cartilage(±s，n=10)

Note:1)P＜0.01 as compared to the normal subject;2)P＜0.05，3)P＜0.01 as compared to the model subject.

圖1 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)影響(×400)Fig.1 Effect of Jinfeng granule on pathomorpholoy of rabbit articular cartilage tissue(×400)

圖2 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-1 表達(dá)的影響(×400)Fig.2 Effect of Jinfeng granule on expression of MMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

圖3 金鳳顆粒對(duì)家兔關(guān)節(jié)軟骨組織TIMP-1 表達(dá)的影響(×400)Fig.3 Effect of Jinfeng granule on expression of TIMP-1 in rabbit articular cartilage tissue(×400)

3 討論

MMP-1 是細(xì)胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白系統(tǒng)，參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織創(chuàng)傷修復(fù)與重塑、炎癥反應(yīng)等過(guò)程［11］。TIMP-1 是MMP-1 的天然拮抗劑，與活化的MMP-1 結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻斷MMP-1 活性，維系MMP-1/TIMP-1 平衡［12］。有學(xué)者研究提示，MMP-1 活化濃度與關(guān)節(jié)炎癥密切相關(guān)，MMP-1/TIMP-1 失衡可能是痛風(fēng)性炎癥病程中難以愈合的重要因素之一［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織排列紊亂，血管充血及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分樣本關(guān)節(jié)軟骨組織壞死，關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-1 顯著升高(P＜0.01)、TIMP-1 顯著下降(P＜0.01)，MMP-1/TIMP-1 失衡(P＜0.01)。提示機(jī)體受到MSU 晶體刺激后，MMP-1 表達(dá)增強(qiáng)，TIMP-1 不同程度的丟失或低表達(dá)，導(dǎo)致MMP-1/TIMP-1 失衡，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力增強(qiáng)，激活炎癥瀑布反應(yīng)而出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織嚴(yán)重充血、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、明顯腫脹、壞死，而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重受損。

經(jīng)金鳳顆粒治療后，高劑量組MMP-1 得到明顯抑制(P＜0.01)，TIMP-1 表達(dá)明顯加強(qiáng)(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1 顯著降低(P＜0.01);中劑量組MMP-1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，MMP-1/TIMP-1趨向平衡(P＜0.05);病理形態(tài)學(xué)改變也得到明顯改善(P＜0.05 或P＜0.01)。研究結(jié)果提示，金鳳顆粒的作用機(jī)制可能與通過(guò)抑制MMP-1 高表達(dá)，加強(qiáng)TIMP-1 表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-1/TIMP-1 平衡，阻斷炎癥反應(yīng)循環(huán)鏈，而實(shí)現(xiàn)其臨床療效。

綜上，金鳳顆粒能有效抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理?yè)p害，其作用機(jī)制可能是與通過(guò)阻斷MMP-1 活性，恢復(fù)MMP-1/TIMP-1 失衡有關(guān)。

［1］黃雪芳.四妙散加味治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床應(yīng)用［J］.中外醫(yī)療，2012，31(4):139.

［2］中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)分會(huì).高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)［J］.中華內(nèi)分泌代謝，2013，29(11):913-920.

［3］Monika Merkle，Andrea Ribeiro，Simone Koppel.TNF-α enhances TLR3 dependent effects on MMP-9 expression in human mesangial cells［J］.Cell Biol Int，2012，36(12):1155-1160.

［4］Thomas CM，F(xiàn)uller CJ，Whittles CE，et al.Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation［J］.Osteoarthr Cartil，2007，15(1):27-34.

［5］佟 穎，孟 潔，金 湯，等.痹寧膠囊對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型IL-1 及MMP-9 的研究［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8(5):543-545.

［6］崔 炎，李玉鳳.崔公讓教授治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)介紹［J］.新中醫(yī)，2009，41(10):12-13.

［7］王曉倩，李 鑫，郭建生，等.金苓痛風(fēng)舒微丸對(duì)高尿酸血癥小鼠血尿?qū)O、肌酐、尿素氮及黃嘌呤氧化酶活性的影響［J］.西北藥學(xué)雜志，2014，29(5):483-486.

［8］王曉倩，李 鑫，郭建生，等.金苓痛風(fēng)舒微丸抗炎作用及其機(jī)制研［J］.中藥新藥與臨床藥理，2014，25(6):700-704.

［9］Mc Cartney-Francis N，Allen JB，Mizel DI，et al.Superssion of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase［J］.J Exp Med，1993，1178(8):749-754.

［10］Jovanovic DVJ，Martel-Pelletier A，di Battista F，et al.Stimulation of 92-kd gelatinase(matrix metalloproteinase 9)production by interleukin-17 in human monocyte/macrophages:a possible role in rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2000，43:1134-1144.

［11］談益芬，唐艷麗，王勝香，等.中藥組方NDRF 對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎家兔滑膜MMP-3、VEGF 分子及其mRNA 的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30(1):57-60.

［12］Tyagi A.Agarwal C，Dwyer-Nield L，et al.Silibinin modulates TNF-alpha and IFN-gamma mediated signaling to regulate COX2 and iNOS expression in tumorigenic mouse lung epithelial LM2 cells［J］.Mol Carcinog，2012，51(10):832.

［13］Rathnayake N，Akerman S，Klinge B，et al.Salivary biomarkers of oral health:a cross-sectional study［J］.J Clin Periodontol，2013，40(2):140.