CIA 小鼠血清中IL-27、IL-10、IL-17 的動態分析①

郭亞春 封桂英 宋鴻儒 邢恩鴻 安 高 趙曉菲 (承德醫學院，承德 067000)

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性、組織特異性的自身免疫性疾病，盡管很多研究證實多種細胞和因子參與了關節的炎癥反應和組織破壞，但抗原特異性T 細胞的激活被認為是RA 發生發展的中心環節，CD4+T 細胞作為效應T 細胞，參與免疫應答的各個階段，在疾病的發生發展中具有重要作用。傳統觀點認為Th1/Th2比例失衡在RA 發病過程中起重要作用［1］，但隨著CD4+T 新亞群Th17/Treg 的發現，越來越多的研究證實Th17/Treg 細胞及其分泌細胞因子的失衡參與了RA 發病過程［2，3］，IL-27 是調控Th17/Treg 平衡的重要因子［4］，但在RA 發病機制中的作用還未肯定，本研究以雞Ⅱ型膠原誘導型關節炎(CIA)小鼠為模型，觀察動物血清中IL-27、IL-17、IL-10 的動態變化，探討IL-27、IL-17、IL-10 與RA 疾病進展的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 54 只雄性SPF 級DBA1/J 小鼠，7～8 周齡，［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號碼:SCXK(滬)2012-0002］。所有動物于SPF 級實驗室均自由飲食，室內溫度20℃～25℃，室內濕度為70%左右，定時換氣，保持通風，每日光照10 h。

1.1.2 試劑與儀器 雞Ⅱ型膠原(Chondrex 公司)，弗氏完全佐劑(Sigma 公司)，Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13plex(eBioscience 公司)，Flow Cytomix Kit，FACSCalibur 流式細胞儀(BD 公司)，ESJ200-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立 參考文獻［5］，將雞Ⅱ型膠原2 mg/ml 與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑，無菌條件下以每只0.1 ml 的劑量在小鼠背部及尾根部多點皮內注射，第21 天相同劑量加強1次。對照組按照上述方法注射等量生理鹽水。

1.2.2 關節癥狀評分 參考文獻［6］，用關節炎指數(Arthritis index，AI)作為判斷模型是否成功的標準，肢體關節腫脹按0～Ⅳ級評分:0=無紅腫;Ⅰ=趾關節稍腫;Ⅱ=趾關節及足趾關節腫脹;Ⅲ=踝關節以下足爪腫脹;Ⅳ=包括踝關節在內的全部足爪腫脹。AI 值=四肢肢體關節腫脹級評分之和(0 級為0 分、Ⅰ級為1 分、Ⅱ級為2 分、Ⅲ級為3 分、Ⅳ級為4 分，總分為16 分)，AI≥4 分為造模成功。AI指數越高，關節炎癥狀越嚴重。

1.2.3 實驗動物分組及取材 54 只DBA1/J 小鼠隨機分為正常對照組18 只(疾病早中晚期各6 只)和模型組36 只(疾病早中晚期各12 只)。各組小鼠均無菌摘眼球取血，制備血清，-80℃保存。

1.2.4 細胞因子的檢測 按試劑盒說明書將樣品中的待測物與連接有熒光珠的抗體緊密結合。加入與生物素結合的第二抗體混合物，特異性抗體與被第一抗體檢測到的待檢測物結合，加入三抗，蛋白鏈霉素-藻紅蛋白與生物素偶聯物和放射性熒光信號結合，通過辨別微球的熒光強度和型號大小，用Flow cytomix 法檢測血清中細胞因子IL-27、IL-17、IL-10 的水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0 軟件包進行統計分析。所有數據以±s 表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠的一般情況、足爪腫脹度及AI 值 加強免疫后模型組小鼠活動遲緩，進食減少，體重較正常組明顯減輕(見表1)，在模型鼠的背部及尾根部形成多處大小不一的潰瘍，至加強后7 d 95%以上模型鼠AI 指數在4 分以上。在CIA 鼠疾病的早期(加強免疫7 d)，模型鼠足墊增厚，足爪充血紅腫明顯，運動受限。隨著疾病進展，至加強14 天，即疾病中期，足爪充血紅腫達高峰，不能負重。至疾病進展晚期(加強35 d)，模型鼠足爪充血紅腫明顯減輕，但足墊依然增厚，足爪開始出現畸形，行動不便;而正常對照組小鼠在整個實驗期一般狀態良好，四肢關節無明顯變化。各組小鼠足爪腫脹度動態變化見表2，AI 指數變化見表3。

2.2 CIA 小鼠血清細胞因子水平 模型組IL-27 在疾病早期顯著降低(P＜0.05)，直至疾病中期依然下降明顯(P＜0.01)，至疾病晚期開始恢復，與對照組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05);模型組IL-17 在疾病早期有增高趨勢，但與正常組比較無明顯區別(P ＞0.05)，到疾病中期明顯高于正常對照組(P＜0.05)，疾病晚期逐漸下降，與對照組比較無統計學意義(P ＞0.05)。IL-10 在CIA 小鼠發病過程中，模型組與對照組相比差異無統計學意義(P ＞0.05)。CIA 小鼠血清細胞因子動態變化見表4。

表1 各組小鼠在疾病不同時期體重變化情況( ±s，n=6，g)Tab.1 Changes of body weight of mice in each group at different time(±s，n=6，g)

表1 各組小鼠在疾病不同時期體重變化情況( ±s，n=6，g)Tab.1 Changes of body weight of mice in each group at different time(±s，n=6，g)

Note:1)P＜0.01 vs normal group.

表2 各組小鼠在疾病不同時期足爪腫脹度變化情況( ±s，n=6，cm)Tab.2 Paws swelling of mice in each group at different time(±s，n=6，cm)

表2 各組小鼠在疾病不同時期足爪腫脹度變化情況( ±s，n=6，cm)Tab.2 Paws swelling of mice in each group at different time(±s，n=6，cm)

Note:1)P＜0.01 vs normal group.

表3 各組小鼠在疾病不同時期AI 值動態變化( ±s，n=6)Tab.3 AI of mice in each group at different time(±s，n=6)

表3 各組小鼠在疾病不同時期AI 值動態變化( ±s，n=6)Tab.3 AI of mice in each group at different time(±s，n=6)

Note:1)P＜0.05 vs normal group.

表4 CIA 小鼠血清細胞因子動態變化(±s，n=6，pg/ml)Tab.4 Changes of cytokines of mice in each group at different time(±s，n=6，pg/ml)

表4 CIA 小鼠血清細胞因子動態變化(±s，n=6，pg/ml)Tab.4 Changes of cytokines of mice in each group at different time(±s，n=6，pg/ml)

Note:1)P＜0.05 ;2)P＜0.01 vs normal group.

3 討論

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性、組織特異性的自身免疫性疾病，目前為止，其發病原因并不是很清楚。許多研究表明，免疫細胞及其分泌的細胞因子參與了疾病的發生和發展。IL-17 是Th17 分泌的主要細胞因子，Th17 細胞在RA 中的作用主要靠IL-17 來實現，本研究也證明了在CIA 小鼠疾病的中期，即關節紅腫最嚴重時期，IL-17 水平明顯升高，說明IL-17 參與了CIA 小鼠的炎癥反應，與文獻報道一致。IL-17 可能通過單獨或與TNF-α、IL-1β 等協同刺激關節滑膜細胞表達IL-6、IL-8 等炎性因子，IL-17 也可能促進滑膜血管新生、軟骨基質的破壞等參與RA 的發病［2］，有文獻表明抑制IL-17 可以改善RA 患者的病情［7］。

Treg 細胞作為一種專職的調節性T 細胞亞群，在抑制自身免疫性疾病的發生，維持自身耐受中發揮重要作用。Treg 通過分泌IL-10 和TGF-β 發揮其免疫調節作用。其中IL-10 是T 細胞和抗原遞呈細胞的有效抑制因子，也可以抑制單核細胞產生炎性細胞因子IL-1 和TNF-α 的釋放，促進IL-1 受體拮抗劑和可溶性TNF-α 受體的產生［8］。在RA 中IL-10 可以抑制Th17 細胞介導的炎癥反應，促使Treg的生成，減輕RA 滑膜組織中淋巴細胞浸潤和破骨細胞的活化，減輕關節腫脹，抑制病變發展，發揮明顯的免疫抑制和免疫調節功能［9，10］。也有研究表明RA 患者IL-10 的水平明顯高于對照組，但與活動期組和緩解期組無顯著性差異，說明IL-10 可能參與了RA 的發病［11］，本研究發現在CIA 小鼠整個病程中IL-10 的變化與正常組比較無明顯區別，說明在CIA 小鼠的發病過程中，IL-10 的分泌紊亂可能失去了其有效的保護性調節功能。

IL-27 是屬于IL-12 超家族的細胞因子，主要由樹突狀細胞、單核巨噬細胞等抗原提呈細胞分泌產生，已有的研究證明IL-27 在自身免疫和組織炎癥反應中起到雙重的調控作用，是平衡促炎和抑炎的關鍵的細胞因子。IL-27 可以阻止Th2 細胞的分化而促進Th1 細胞及其細胞因子的分泌，但在Th1 細胞高度極化時，IL-27 可以限制Th1 型免疫反應的強度和持續時間，從而保護機體免受過度的免疫反應的損傷［12］，同時IL-27 可以促進Treg 的分化而抑制Th17 的產生，在抑炎方面起重要作用［13］。有研究表明，在膠原誘導型關節炎小鼠(CIA)中，注射IL-27，可以使IL-6 和IL-17 等炎性細胞因子水平降低，改善關節炎的癥狀，另外還有研究表明IL-27 可能在RA 病情加重時具有免疫病理作用，有可能作為疾病活動度的新的替代指標，用其作為治療自身免疫性疾病的抑制劑的效果并不樂觀［14］。本研究通過觀察小鼠血清中IL-27 在疾病的發病過程中動態變化情況，發現在CIA 小鼠關節明顯紅腫的早期、中期IL-27 的水平較正常組明顯下降，說明IL-27 可能參與了CIA 小鼠的急性期的炎癥反應，其抑炎的免疫調控功能失調，其機制可能在調節Th17/Treg及其分泌細胞因子IL-17、IL-10 平衡的方面出現障礙。而在小鼠關節紅腫減弱，關節畸形明顯的時期，IL-27 的水平和正常組無明顯區別，說明IL-27 有可能和關節畸形的發生有一定的關系。

綜上所述，免疫細胞及其分泌的細胞因子網絡參與了RA 的發生和發展，不同免疫細胞及其細胞因子的網絡平衡可能在RA 發病的不同時期起不同的作用，研究免疫細胞及其細胞因子的網絡平衡的調節可能為RA 的治療提供新的思路，但關于IL-27、IL-17、IL-10 的平衡與RA 疾病進展關系的確切機制還有待于進一步的研究。

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