microRNA-199a/b-3p 表達與肝細胞癌臨床預后的相關性①

劉 磊 李首慶 米旭光 方艷秋 (吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，長春 130021)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)作為消化系統常見的惡性腫瘤，約55%發生在中國［1］，肝細胞癌起病隱匿，發現時常到中、晚期，手術切除5 年復發率高達65%以上［2］。因此，尋找有效的預測指標和有效治療靶點顯得尤為重要。microRNA-199a/b-3p 被發現在多種腫瘤組織中低表達，體內外實驗發現其具有抑癌活性［3-6］。在肝癌中其表達降低，但是其與肝細胞預后及病理特征的關系尚不清楚［3］。本研究旨在肝細胞癌組織標本的基礎上分析miR-199a/b-3p 與肝細胞癌預后及相關病例參數的關系，繼而探討miR-199a/b-3p 與肝細胞癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本 本研究共收集HCC 組織標本107例，患者基本資料見表1。每例肝細胞癌患者至少經過超聲、CT 和組織病理學中的兩種方法，并結合肝炎病史及AFP 水平而確診，診斷依據為《原發性肝癌診療規范(2011 年版)》［7］。標本均取自2011年1 月至2014 年12 月之間手術的肝細胞癌患者(標本來自吉林省人民醫院、吉林大學第一醫院、吉林大學第二醫院、吉林大學中日聯誼醫院)，肝細胞癌與對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm 以上且病理證實無癌細胞殘留)新鮮組織于-80℃冰箱超低溫保存。

1.2 實驗試劑 AFP 抗體與免疫組化試劑盒(武漢博士德公司，中國)、microRNA-199a-3p 和U6 引物(上海生工，中國)、TRIzol?Reagent(Life Technologies，美 國)、FS Universal SYBR Green Master(Roche，美國)、GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，美國)、其他常規試劑(北京化工，中國)。

1.3 組織總RNA 提取 所有-80℃冰箱超低溫保存組織樣本浸入液氮，取出后研磨，加入TRIzol 裂解，氯仿沉淀蛋白，離心取上清，異丙醇沉淀RNA，75%乙醇溶液洗滌沉淀兩次，每個獲得的RNA 沉淀重懸于20 μl DEPC 水，所有的RNA 質量通過分光光度計檢測并定量。

1.4 microRNA-199a/b-3p 檢測 每樣本取1 μg 總RNA，依據GoScriptTM Reverse Transcription System試劑盒方法進行cDNA 合成。根據FS Universal SYBR Green Master 說明書，配置10 μl 反應體系，U6 為內參，反應結束后分析qRT-PCR 反應曲線，得到Ct 值，采用2-ΔΔCt法分析miR-199a/b-3p 表達量。miR-199a/b-3p 定量引物:F-GTCAC AGTAG TCTGC ACAT;R-GTGCA GGGTC CGAGGT。U6 定量引物:F-CTCGC TTCGG CAGCA CA;R-AACGC TTCAC GAATT TGCGT。所有樣本重復三次。

1.5 隨訪 電話及門診結合的方式隨訪，術后無瘤生存時間為自手術之日起至其影像學發現復發，或末次隨訪時間(2014 年12 月)所經歷的時間。

1.6 統計學分析 采用SPSS19.0 軟件對所得數據進行統計分析，選用成組設計的單因素方差分。P＜0.05 為差異具有顯著統計學意義。miR-199a/b-3p 在肝癌組織中表達高低以高于或低于中位數計算。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織與癌旁組織中miR-199a/b-3p表達水平差異 通過對107 例HCC 患者的癌組織及癌旁組織的miR-199a/b-3p 表達急性定量分析，我們發現，miR-199a/b-3p 在癌組織的中位相對表達量為0.537 ±0.378，顯著低于相應癌旁組織的相對表達量2.113 ±0.505(P＜0.05)，見圖1。

2.2 miR-199a/b-3p 表達與病理參數的關系 對107 例患者病理參數與其癌組織及癌旁組織中miR-199a/b-3p 表達比進行歸類分析，發現miR-199a/b-3p 相對表達量與患者的年齡、性別、乙肝感染、AFP表達、肝硬化及TNM 分期無關，但與轉移相關(表2)。

2.3 miR-199a/b-3p 表達與臨床預后的關系 以miR-199a/b-3p 相對表達量的中位數為界限，將107例患者分為miR-199a/b-3p 高表達組，共19 例;低表達組，共88 例。經Kaplan-Meier 生存分析發現，miR-199a/b-3p 相對高表達的患者術后無瘤生存期顯著優于miR-199a/b-3p 低表達患者(圖2)。

圖1 HCC 組織miR-199a/b-3p 相對表達水平Fig.1 Relative expression of miR-199a/b-3p in HCC

表2 HCC 組織中miR-199a/b-3p 與臨床病理參數的關系Tab.2 Relationship between expression of miR-199a/b-3p and clinic pathological features of HCC

圖2 miR-199a/b-3p 高表達與低表達HCC 的無瘤生存期比較Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of HCC patients with higher or lower expression of miR-199a/b-3p

3 討論

人類基因組中存在著約1 000 個microRNA 基因，被證實的miRNA 已有500 多種，人類三分之一的基因受miRNA 的調控［8，9］。隨著對miRNA 的深入研究，發現miRNA 作為一種新型的調控因子，調節細胞的增殖、分化和凋亡。在人類基因組中，miRNA 多聚集在與腫瘤相關的一些基因多變區以及脆性位點，其異常表達與多種腫瘤的發生發展密切相關［10，11］。因此，miRNA 在腫瘤診斷、腫瘤分型、預后判斷及基因治療的作用會越來越受到關注，miRNA可能成生物靶向治療的新靶點，未來此類藥物會不斷出現，可能為腫瘤及其他疾病帶來治療的新希望。

有研究顯示，miR-199a-3p 在前列腺癌高、低轉移潛能細胞中存在表達差異，高轉移潛能1E8 細胞中miR-199a-3p 表達水平明顯低于低轉移潛能2B4細胞，上調miR-199a-3p 會減弱1E8 細胞的運動轉移能力，說明上調miR-199a-3p 可以抑制前列腺癌細胞的運動遷移能力［4］。MiR-199a-3p 在腎癌細胞中明顯低表達，在78%(14/18)的腎癌組織中明顯低表達;上調miR-199a-3p 可顯著抑制腎癌細胞的增殖、存活和侵襲并能誘導細胞周期G1 期阻滯，這表明miR-199a-3p 具有作為腎癌診斷和治療靶點的潛能［5］。另有研究顯示miR-199a-3p 在骨肉瘤細胞中顯著低表達，而外源轉入骨肉瘤細胞后，可顯著抑制細胞生長侵襲，誘導了細胞周期G1 期阻滯，和mTOR 和Stat3 表達被抑制，說明miR-199a-3p 抑制的靶基因在骨肉瘤細胞存活發展中起到關鍵作用，可作為骨肉瘤治療的靶點［6］。而在肝細胞癌(HCC)組織樣本分析中發現，miR-199a-3p 表達水平與正常肝組織相比顯著下調。在肝細胞癌細胞中外源表達miR-199a-3p 可顯著抑制肝細胞癌細胞的增殖。通過病毒載體導入miR-199a-3p 后可減小肝細胞癌細胞異種移植物的體積，說明miR-199a-3p抑制的靶基因在HCC 的存活發展中發揮重要作用，是HCC 新的治療靶點［3］。但miR-199a-3p 與肝細胞癌預后及相關病理特征的關系尚不清楚。

本研究通過檢測107 例肝細胞癌組織及對應癌旁組織的miR-199a/b-3p 表達水平變化，結果顯示，在癌組織的中位相對表達量為0.537 ±0.378，顯著低于相應癌旁組織的相對表達量2.113 ±0.505(P＜0.05)，說明miR-199a/b-3p 作為重要抑癌基因其表達被HCC 抑制。通過病理參數與其癌組織與癌旁組織中miR-199a/b-3p 表達比進行歸類分析，發現miR-199a/b-3p 相對表達量與患者的年齡、性別、乙肝感染、AFP 表達、肝硬化及TNM 分期無關，但與轉移顯著相關，說明miR-199a/b-3p 抑癌機制可能與抑制轉移相關。最后，我們以癌組織中miR-199a/b-3p 相對表達量的中位數為界限，將107 例患者分為miR-199a/b-3p 高表達組，共19 例;低表達組，共88 例。經Kaplan-Meier 生存分析發現，miR-199a/b-3p 相對高表達的患者術后無瘤生存期顯著優于miR-199a/b-3p 低表達患者，說明miR-199a/b-3p 低表達與預后不良相關。綜上所述，miR-199a/b-3p 在肝癌中作為抑癌基因存在，其低表達可提示預后不良;miR-199a/b-3p 對肝癌的發生發展轉移起到重要抑制作用，可以作為有效的肝癌治療靶點。

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