microRNA-204 在鼻咽癌中的表達及生物學意義研究

蔣成義 汪洪濤 周 蕾 江 濤 許亞佳 (蚌埠醫學院第一附屬醫院，蚌埠 233004)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種惡性程度較高的鼻咽部上皮細胞來源的惡性腫瘤［1］，近年來，鼻咽癌的發病率不斷攀升，因其病變發展隱匿，大多數患者在就診時已處于腫瘤晚期。晚期鼻咽癌主要采用放射治療聯合全身化療的方法，但患者初治反應率低，5 年生存率不足60%［2］。因而，鼻咽癌已成為危害廣大群眾健康的重要因素之一。

microRNAs(miRNA)是一類短鏈的非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA 特異性結合進而降解mRNA 單鏈或抑制其翻譯［3］。研究表明，NPC 組織中存在多種miRNA 的異常表達，如miR-21 在NPC 組織中表達升高并與NPC 臨床分期及淋巴結轉移密切相關，體外實驗證實miR-21 通過下調凋亡相關蛋白PDCD4 及Fas-L 來促進腫瘤抗凋亡作用［4］;高生物活性的miR-18a 可以通過降解microRNA 成熟過程中的關鍵酶DICER1 而促進NPC 細胞的增殖、侵襲及轉移能力［5］。miR-204 已經被證實是一種重要的腫瘤調節基因，在多種人類惡性腫瘤中存在表達下調甚至缺失，并與腫瘤增殖、凋亡等多種生物學行為密切相關［6-8］。通過生物信息學檢索發現，B 淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及人組蛋白脫乙酰酶1(Sirtuin type 1，SIRT1)是miR-204 的下游靶點之一，并在多種腫瘤的體外實驗中得到證實。但是，miR-204 在人鼻咽癌中的臨床病理意義及其具體分子機制尚不清楚。本研究通過檢測miR-204 在鼻咽癌及對應癌旁組織中的表達情況及其對下游潛在靶點Bcl-2、SIRT1 的調控作用，研究miR-204 在鼻咽癌發生、發展中的臨床意義作用機制，為鼻咽癌的診斷與治療提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床標本及主要試劑 本課題經我院醫學倫理委員會批準審核后開展。收集2012 年3 月至2014 年3 月間于我院耳鼻喉頭頸外科行組織病理活檢的鼻咽癌及對應癌旁鼻黏膜組織標本43 例，其中男33 例，女10 例，年齡42～74 歲，平均年齡(55.7 ±1.6)歲。所有入組患者術前均未接受放化療。標本于離體30 min 內取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。Trizol 試劑及脂質體2000(LipofectamineTM2000)購自美國Invitrogen 公司;逆轉錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(#1622)購自美國Fermentas 公司;real time PCR 試劑盒SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(#RR420A)購自寶生生物工程(大連)有限公司;miR-204 特異性逆轉錄引物、RNU6B 引物及人工合成的miR-204 模擬物(miR-204 mimics)均購自廣州銳博生物科技有限公司;Bcl-2 引物(5'-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3';5'-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3')，SIRT1 引物(5'-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3';5'-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3')，β-actin 引 物(5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3';5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3')由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成;兔抗人Bcl-2多克隆抗體(sc-492)、兔抗人SIRT1 多克隆抗體(sc-74504)及鼠抗人β-actin 單克隆抗體(sc-47778)均購自美國SANTA CRUZ 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒及ECL 化學發光試劑盒購自美國Milipore 公司。

1.2 qRT-PCR 按RNA 提取試劑說明書方法提取NPC 及癌旁組織中的microRNA 及mRNA，按以下條件進行RNA 反轉錄反應:預變性70℃5 min，逆轉錄37℃1 h，酶滅活85℃5 min。以2 μl cDNA 配制Real-time PCR 體系，按如下條件進行PCR 反應:預變性95℃30s，變性95℃5 s，退火延伸60℃30 s，擴增40 個循環。以RNU6B 基因或β-actin 基因為內參，采用2-△△Ct法計算miR-204 相對表達量。每個樣本獨立重復實驗3 次。

1.3 免疫組化 組織標本常規脫水、石蠟包埋，切片制作4 μm。切片經脫蠟、水化后，pH6.0 枸櫞酸緩沖液進行抗原熱修復;30 ml/L H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶活性，100 ml/L 山羊血清封閉;分別滴加兔抗人Bcl-2 抗體(1∶100)、兔抗人Sirt1 多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜;洗滌后，加生物素標記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min;洗滌后滴加辣根過氧化物酶-鏈酶卵白素復合物進行反應，DAB顯色、蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片經由2 位高年資病理醫師，在高倍鏡(×400)下隨機選取10 個視野，按以下標準［9］單獨閱片、評分:染色強度評分:0 分:陰性;1 分:弱陽性;2分:中度陽性;3 分:強陽性。陽性腫瘤細胞(或肝細胞)百分比評分:陽性細胞≤5% 為0 分;6%～25%為1 分;26%～50% 為2 分;51%～75% 為3 分;75% 為4 分。每視野評分=染色強度評分×陽性腫瘤細胞(或鼻黏膜細胞)百分比評分，取10 個視野的平均得分作為切片的最終評分。

1.4 細胞培養 人鼻咽癌CNE-2 細胞株培養于含10%FBS 的1 × DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下進行培養。每2～4 d 傳代一次，穩定傳代2～3 代后，取對數生長期細胞進行實驗。

1.5 細胞轉染 CNE-2 細胞接種于6 孔板中，用含10%FBS 的1 ×DMEM 培養基培養細胞至融合度達50%左右，實驗分組及處理如下:實驗組每孔加入100 pmol miR-204 mimics 及5 μl 轉染試劑;對照組每孔加入100 pmol 陰性對照(Negative Control，NC)mimics 及5 μl 轉染試劑。每孔加入不含血清的1 ×DMEM 培養基調整終體積至2 ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養6 h 后，更換完全培養基繼續培養。獨立重復實驗3 次。

1.6 Western blot 取轉染72 h 后的CNE-2 細胞，加入RIPA 細胞裂解液置冰上裂解10 min，裂解液收集于1.5 ml EP 管中，4℃、14 000 r/min 離心10 min 后取上清。BCA 法測定總蛋白濃度，每孔加入50 μg 蛋白樣品，10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白。采用Bio-Rad 半干轉印系統，20 V 轉膜1 h，5%BSA 室溫封閉1.5 h 后加入1∶1 000 稀釋的Bcl-2一抗、SIRT1 一抗及β-actin 一抗，4℃搖晃孵育過夜，0.01 mol/L TBST 漂洗5 min ×3 次后加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h。0.01 mol/L TBST 漂洗5 min × 3 次。于暗室內，在膜上滴加ECL 溶液，并使膠片曝光，全自動洗片機洗片。每樣本獨立重復實驗3 次。

1.7 統計學處理 采用SPSS13.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌組織及對應癌旁組織中miR-204 的相對表達量 經qRT-PCR 技術檢測，43 例鼻咽癌組織中miR-204 的相對表達量顯著低于癌旁鼻黏膜組織(2.351 ±0.193 vs 8.743 ±0.361)。統計學檢驗證明差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 miR-204 表達水平與鼻咽癌患者臨床病理特征間相關性 為研究miR-204 表達水平與腫瘤臨床特征間的相關性，將43 例鼻咽癌組織按患者性別、吸煙與否、有無淋巴結轉移、病理分型及TNM 分期等臨床病理資料間的相關性進行卡方分析，經Student-t檢驗，NPC組織中miR-204 低表達與腫瘤淋巴結轉移和高TNM 分期(Ⅲ+Ⅳ)間具有顯著相關性(P＜0.05)。

2.3 腫瘤組織中miR-204 與Bcl-2 及Sirt1 蛋白表達間的相關性 為探討鼻咽癌組織中miR-204 與其下游潛在靶點Bcl-2 及SIRT1 表達間的相關性，我們分別在miR-204 低表達及高表達鼻咽癌組織中對Bcl-2 及SIRT1 進行免疫組化染色，并對統計結果進行相關性分析。免疫組化結果顯示，miR-204 低表達組中Bcl-2 及SIRT1 蛋白表達強度顯著高于miR-204 高表達組(P＜0.05，圖2A、B)。Spearman 相關分析結果顯示，miR-204 與Bcl-2 及SIRT1 的表達均呈負相關(P＜0.05，圖2C)。

圖1 miR-204 在鼻咽癌及對應癌旁組織中的表達Fig.1 Expression of miR-204 in NPC and tumor adjacent tissues

表1 miR-204 表達與鼻咽癌患者臨床病理特征的關系(n=43)Tab.1 Clinical correlation of miR-204 expression in NPC(n=43)

圖2 Bcl-2 及SIRT1 在鼻咽癌組織中的表達及與miR-204 的相關性Fig.2 Expression correlation of Bcl-2，SIRT1 and miR-204 in NPC tissues

圖3 過表達miR-204 下調CNE-2 細胞中Bcl-2 及SIRT1的表達Fig.3 miR-204 knocked down expression of Bcl-2 and SIRT1 in CNE-2 cells

2.4 過表達miR-204 對鼻咽癌CNE-2 細胞中Bcl-2及SIRT1 表達的影響 與對照組相比，向CNE-2 細胞內轉染入miR-204 mimics 后可將CNE-2 細胞內miR-204 的表達量升高約(3.403 ± 0.197)倍(圖3A，P＜0.05)。qRT-PCR 及Western blot 檢測發現，與對照組相比，過表達miR-204 顯著下調了CNE-2細胞內Bcl-2(1.000 vs 0.303 ± 0.032)及SIRT-1(1.000 vs 0.347 ±0.021)mRNA(圖3B)和蛋白(圖3C)的表達水平(P＜0.05)。

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其男性發病率約為20.2/10 萬人，女性為7.8/10 萬人。由于鼻咽癌發病隱匿，生物學惡性程度較高，大部分患者就診時已處于臨床晚期，行單純放射治療的5 年生存率僅為30%左右［10］。隨著放療技術的進步，化療藥物及方案的不斷更新，以放療為主、化療及生物靶向治療相結合的綜合治療方案，在鼻咽癌的診療中呈現出相當的優勢。然而，腫瘤患者的個體生物學差異限制了鼻咽癌患者的初次治療效果，一線方案治療失敗后的補救治療效果亦較差［11］。因而，尋找新的靶向抗腫瘤分子并探究其抗腫瘤機制，已成為提高化療效果、改善鼻咽癌患者預后的關鍵方法之一。

鼻咽癌組織中存在大量microRNA 異常表達，并在鼻咽癌的生物學進展中發揮重要作用。例如，miR-320a 在鼻咽癌組織及鼻咽癌細胞中表達量均顯著降低，體外過表達miR-320a 可通過下調BMI-1的表達而顯著抑制NPC 細胞的生長、遷移及侵襲能力［12］;而在1 077 例NPC 組織中的研究發現［13］，miR-30a 在NPC 組織中的表達量則較正常鼻黏膜組織明顯升高并與患者不良預后相關，體外及體內實驗均證實miR-30a 通過促進NPC 細胞的上皮細胞間充質轉化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)而促進腫瘤的侵襲與轉移能力。本課題通過研究證實，miR-204 在NPC 組織中的表達水平顯著低于對應癌旁組織，并且其低表達狀態與腫瘤淋巴結轉移及高TNM 分期等惡性臨床病理特征密切相關。提示miR-204 在NPC 進展中具有重要的調控作用。

作為一種重要的抑癌分子，miR-204 可通過下調腫瘤中MEIS1、FOXC1、Mcl-1 等多個癌基因的表達水平來發揮其抗腫瘤作用［14-16］。為進一步研究miR-204 在NPC 中的抑癌分子機制，我們首先在組織學水平檢測了miR-204 下游潛在靶點Bcl-2 及SIRT1 的表達情況，結果證實，miR-204 與Bcl-2 及SIRT1 的表達間呈顯著負相關關系，提示在NPC 中miR-204 可能對Bcl-2 及SIRT1 發揮調控作用。我們進而通過體外轉染方法，在NPC 細胞CNE-2 中成功過表達miR-204，通過qRT-PCR 及Western blot 檢測發現，過表達miR-204 后CNE-2 細胞內Bcl-2 及SIRT1 mRNA 及蛋白質的表達水平出現顯著下調。在臨床實踐中，以鉑類藥物為基礎的化療方案在NPC 的化療中具有重要作用，新近研究證實，miR-204 可通過下調Bcl-2 的表達來增強胃癌及神經母細胞瘤對順鉑的化療敏感性［17，18］，本課題研究結果也表明miR-204 可顯著下調NPC 腫瘤細胞中Bcl-2的表達，結合miR-204 在NPC 組織中的低表達狀態，提示miR-204 表達缺失可能是NPC 患者對鉑類藥物化療耐藥的重要機制之一。上皮細胞-間充質轉化是腫瘤發生淋巴結及遠處轉移的重要分子機制之一，在胃癌中的研究表明［19］，miR-204 能夠通過下調胃癌細胞內SIRT1 蛋白的表達進而調控E 鈣黏蛋白、N 鈣黏蛋白等多種EMT 重要分子的表達水平，最終實現抑制胃癌細胞的侵襲能力。本課題體外實驗證實，過表達miR-204 可顯著下調NPC 細胞中SIRT1 的表達水平，組織學研究表明，miR-204 低表達與NPC 腫瘤淋巴結轉移及高TNM 分期密切相關，結合既往研究結果可以推測miR-204 可能通過下調NPC 細胞中SIRT1 的表達、抑制腫瘤EMT 來發揮其抗腫瘤侵襲、轉移作用。

綜上所述，miR-204 在鼻咽癌組織表達顯著下調，低表達miR-204 與鼻咽癌惡性臨床病理特征密切相關。miR-204 可能通過下調Bcl-2 及SIRT1 的表達水平從而發揮其腫瘤抑制作用。因此，miR-204 在鼻咽癌的診斷及生物分子治療中具有一定的發展潛力。

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