沉默GRP94 表達對肺癌A549 細胞增殖能力的影響①

鄧 雨 杜 銘 (重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科，重慶 400016)

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其中其發病率和死亡率增長最快［1］。非小細胞肺癌占總量的80%，由于缺乏有效的早期診斷及綜合治療，其5 年生存率很低［2］。而癌細胞的惡性增殖是治療肺癌患者的一大難題原因，因此對肺癌細胞增殖過程中發揮重要作用的因子的研究對于肺癌的治療及預后具有重要意義。

通過化學合成siRNA 特異性下調靶基因的表達，而進行的分子靶向治療是近年來的研究熱點［3］，GRP94 基因是內質網的豐度蛋白之一，作為內質網分子伴侶參與了蛋白質的合成與降解。研究表明GRP94 在乳腺癌、胰腺癌及肺癌等多種腫瘤中呈高表達趨勢，且與腫瘤化療藥物的耐藥性密切相關［4-7］。本研究在mRNA 及蛋白水平分別檢測了分子伴侶GRP94 在肺癌細胞系中的表達情況，進一步針對GRP94 基因化學合成小干擾RNA，研究其對人肺腺癌A549 增殖能力的影響極其可能機制，為探討GRP94 在肺癌增殖過程中的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI1640 培養基、胎牛血清購自Gibco 公司;兔抗人cyclinD1 單克隆抗體購自CST公司;兔抗人c-myc 單克隆抗體購自Bioworld 公司;兔抗人GRP94 單克隆抗體購自Abcam 公司;脂質體轉染試劑Lipofectamine2000 購自Invitrogen 公司;Total RNA 提取試劑盒購自OMEGA 公司;蛋白提取試劑盒和ECL 發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 siRNA 的合成 根據GRP94 基因在Genebank中的序列(NO:NM-003299.2)設計靶向Grp94 基因的siRNA 序 列(UACUGUACCAUCCACAUCA)，siRNAnegative control 序列，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，干粉siRNA 用DEPC 水稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。

1.3 細胞培養及轉染 人肺癌細胞(A549、H1299、H226、H460)及肺支氣管上皮細胞(BEP-2D，HBE)由重慶醫科大學分子醫學與腫瘤研究中心保存。經復蘇后于37℃，5%CO2孵箱中培養，A549 細胞轉染前24 h，以2 ×105個/孔細胞接種于6 孔培養板中，當細胞達80%～90%融合時，參照Lipofectamine2000產品說明書，分別將siRNA-NC 和siRNA-GRP94 轉染至六孔培養板中，轉染6 h 后更換新鮮培養基。

1.4 qRT-PCR 法 收集轉染48 h 后各組細胞，按照Total RNA 提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。采用SYBR Green 法進行qRT-PCR，用于擴增GRP94 cDNA 的上游引物:5'-GGGAGGTCACCTTCAAGTCG-3'。下游引物:5'-GGGTGTAGACGTGGAGCTC-3';β-actin 上游引物:5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'，下游引物:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，反應條件為:95℃3 min;95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，共39 個循環;同一實驗重復3 次，實驗數據分析采用2-ΔΔCT法計算。

1.5 Western blot 法 分別收集轉染72 h 后各組細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。加入5 × SDS 上樣緩沖液100℃，變性5 min;每孔40 μg，80V 恒壓SDS-Page 電泳，250 mA恒流2 h 冰浴，電轉至PVDF 膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗GRP94(1∶1 000)，β-actin (1∶3 000)，c-myc (1∶500)，cyclinD1 (1∶1 000)4℃過夜，次日TBST 漂洗5 min ×5 次，加入HRP 標記的二抗(羊抗兔1 ∶4 000)室溫孵育1 h，TBST 漂洗10 min×3 次，ECL 化學發光顯影。

1.6 CCK-8 測定細胞的生長增殖曲線 將轉染24 h 后的各組細胞消化收集，計數，以每孔3 000 個/100 μl 接種于96 孔板中，待細胞貼壁后記為1 d 分別在1、2、3、4、5 d 時間點分別加入10 μl 的CCK-8溶液，37 度孵育1.5 h 后在波長450 nm 處檢測其光密度值。

1.7 平板集落實驗檢測細胞克隆形成能力 收集轉染24 h 后的各組細胞，計數，以每孔1 000 個/2 ml 接種于6 孔培養板中，2～3 d 換液，10 d 后取出，PBS 漂洗3 次，加入預冷分甲醇室溫固定30 min后，0.1%結晶紫染色。

1.8 統計學分析 采用SPSS13.0 統計軟件，各組實驗數據均以±s 表示，配對組間采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR、Western blot 分別檢測細胞在肺癌細胞系及肺支氣管上皮細胞系中的表達 結果顯示:人肺癌細胞系A549、H1299、H460、H226 中GRP94 mRNA 及蛋白表達水平明顯高于肺支氣管上皮細胞系HBE、BEP-2D，尤其GRP94 在A549 細胞中表達最高(P ＜0.05，P ＜0.01)。見圖1、2。

圖1 qRT-PCR 檢測不同肺癌細胞及肺支氣管上皮細胞中GRP94 mRNA 的表達水平Fig.1 Expression of GRP94 mRNA detected by qRTPCR in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

圖2 Western blot 檢測不同肺癌細胞及肺支氣管上皮細胞中GRP94 蛋白表達水平Fig.2 Expression of GRP94 protein detected by Western blot in four lung carcinoma cells and two lung bronchial epithelial cells

2.2 Real-time PCR、Western blot 分別在mRNA和蛋白水平驗證GRP94siRNA 沉默效果 結果顯示:siRNA-NC 組中GRP94 基因的相對表達量明顯高于siRNA-GRP94 組，差異具有統計學意義(P ＜0.01)，見圖3、4，說明GRP94 基因被有效沉默。

2.3 沉默GRP94 對A549 細胞增殖能力的影響通過CCK-8 法檢測細胞貼壁后1、2、3、4、5 d的光密度值，繪制生長曲線，結果顯示，與siRNANC 相比，siRNA-GRP94 組中細胞生長速率明顯下降，說明沉默GRP94 對A549 細胞生長有抑制作用，差異具有統計學意義(P ＜0.05)，見圖5。

2.4 沉默GRP94 對A549 細胞克隆形成能力的影響 平板集落實驗顯示，與siRNA-NC 組相比，siRNA-GRP94 組細胞克隆數明顯下調，說明沉默GRP94 抑制了A549 細胞的克隆形成能力，差異具有統計學意義(P ＜0.05)，見圖6。

2.5 沉 默GRP94對肺癌A549細胞c-myc、cyclinD1 表達的影響 Western blot 檢測結果顯示，siRNA-GRP94 組c-myc、cyclinD1蛋白表達水平明顯低于siRNA-NC 組(圖7)，說明沉默GRP94基因表達的同時能抑制c-myc 和cyclinD1 的表達。

圖3 Real-time PCR 檢測GRP94mRNA 表達水平Fig.3 Expression of GRP94 mRNA detected by Real-time PCR

圖4 Western blot 檢測GRP94 蛋白表達水平Fig.4 Expression of GRP94 protein detected by Western blot

圖5 CCK-8 測定沉默GRP94 基因表達對A549 胞的生長影響Fig.5 A549 cells were transfected with NC or GRP94 siRNA and cell growth was evaluated by CCK-8 assay

圖6 平板集落實驗檢測沉默GRP94 對A549 細胞克隆形成能力的影響Fig.6 Clonogenic capacity of silencing GRP94 expression in A549 cells were detected by colony formation assay

圖7 沉默GRP94 對cyclinD1、c-myc 蛋白表達的影響Fig.7 Expression of cyclinD1 and c-myc protein detected by Western blot

3 討論

GRP94 基因是HSP90 家族成員之一，調節細胞的結構產生內質網應激進而誘導細胞凋亡［8，9］。研究發現，GRP94 的表達水平與多種腫瘤的細胞分化程度呈負相關，與臨床分期呈正相關趨勢［10，11］。姚元春等［12］的研究表明在人胃癌組織中GRP94 的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且隨著腫瘤的大小表達發生變化，腫瘤體積越大，表達越強，提示我們分子伴侶GRP94 參與了腫瘤細胞的生長過程，而GRP94 在肺癌細胞中的研究鮮為人知。本研究檢測了GRP94 在肺癌細胞及肺支氣管上皮細胞中的表達，發現GRP94 在肺癌細胞中呈高表達，且在A549 細胞中表達最高。同時采用RNAI 技術特異性下調GRP94 表達，觀察在肺癌A549 細胞株的增殖能力的變化，結果顯示，敲降GRP94 基因后，A549細胞增殖能力明顯下降，克隆形成能力明顯降低，說明高表達GRP94 與肺癌的惡性增殖緊密相關。而沉默GRP94 表達后，c-myc、cyclinD1 表達明顯受到下調，提示GRP94 可能通過影響其表達參與調控肺癌的增殖能力。

GRP94 可能通過不同的途徑調節腫瘤的發生發展，Tramentozzi 等［13］研究發現GRP94 依賴PI3K/AKT 信號通路的活化來促進血管生成。有資料表明，GRP94 可能靶向LRP6 膜蛋白活化wnt/β-catenin 信號通路參與了腫瘤的發生和發展［14，15］，提示我們在肺癌中高表達的GRP94 可能通過激活wnt/β-catenin、PI3K/AKT 信號通路協同調節下游cyclinD1、c-myc 等關鍵分子的表達來促進肺癌的增殖能力，進而影響肺癌的發生發展。此外，本研究為體外實驗，GRP94 基因對在體內肺癌的作用仍需進一步研究。

綜上所述，肺癌中高表達的GRP94 參與了肺癌的發生發展，通過檢測GRP94 的表達量將可能作為腫瘤生物學行為的生物指標。隨著對GRP94 基因功能研究的完善，其必將成為診斷和預測肺癌的分子標志物和抗肺癌增殖的生物治療靶點。

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