鼠傷寒沙門菌SL1344 株sipB 和crp 基因缺失對(duì)其侵襲力影響的比較①

陳松彪 張春杰 程相朝 李銀聚 李 靜 何 雷 郁 川 張明亮 余祖華 賈艷艷 趙戰(zhàn)勤

(河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003)

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)是一群非適應(yīng)性或泛嗜性的沙門菌，具有廣泛的宿主，是目前世界各國(guó)分離率最高的菌型之一。該菌能引起各種哺乳動(dòng)物以及人類發(fā)生全身性感染，具有重要的公共衛(wèi)生意義［1］。

沙門菌的致病機(jī)制主要與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)有關(guān)，由SPI-1 和SPI-2 兩個(gè)毒力島編碼，毒力島(Pathogenicity island)是存在于病原菌染色體上的特定區(qū)域，編碼與毒力相關(guān)的基因，負(fù)責(zé)細(xì)菌效應(yīng)蛋白的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)改變宿主細(xì)胞的生理機(jī)能來(lái)促進(jìn)細(xì)菌的侵入與存活。因此，T3SS 所分泌的蛋白在利用宿主細(xì)胞促進(jìn)細(xì)菌侵入，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，以及創(chuàng)造胞內(nèi)生小境來(lái)促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制等方面發(fā)揮著重要作用［2］。

沙門菌入侵蛋白是侵入過(guò)程的起始中心，sipB是編碼沙門菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其中一個(gè)基因，已有研究表明SipB 可以調(diào)節(jié)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)調(diào)節(jié)蛋白的傳遞［3］。越來(lái)越多的證據(jù)表明位于毒力島1(SPI-1)上的SipB 效應(yīng)蛋白主要通過(guò)天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)激活I(lǐng)L-1b 和IL-18 促進(jìn)宿主細(xì)胞的壞死和凋亡［4，5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)SipB 蛋白能夠插入到宿主的細(xì)胞膜中形成一個(gè)離子通道，從而能夠改變效應(yīng)蛋白在宿主細(xì)胞中的位置［6］，SipB 蛋白在維持細(xì)菌細(xì)胞膜完整性和耐高滲性方面扮演著重要的角色［7］。而crp 基因編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白，其突變株能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，消除了細(xì)菌在哺乳動(dòng)物中攝取cAMP 的唯一途徑，其作為沙門菌重要的毒力基因，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在不斷地研究［8，9］。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)crp 和sipB缺失株均能夠顯著降低對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力［10，11］，但是這種毒力的降低是由什么機(jī)制引起的目前尚少見(jiàn)有關(guān)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)crp 和sipB 缺失株的其他生物學(xué)特性進(jìn)一步的研究，以小鼠和細(xì)胞建立感染模型，分別對(duì)兩種缺失株進(jìn)行體內(nèi)和體外的侵襲力試驗(yàn)，為crp 和sipB 缺失株的減毒機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)條件 鼠傷寒沙門菌SL1344 強(qiáng)毒株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng);SL1344Δ sipB、SL1344Δ crp、HeLa 細(xì)胞由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;鼠傷寒沙門菌在37℃靜止或振搖培養(yǎng);細(xì)胞在37℃和5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 生化鑒定試劑由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn);沙門菌屬診斷血清(11 種)及各種單因子血清由寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn);DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Sigma 公司;Triton X-100 購(gòu)自Sangon 公司。麥康凱瓊脂和SS 瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸出物等由英國(guó)OXOID 公司生產(chǎn);6 周齡的BALB/c 小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(豫)2010-0002］。

1.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 將缺失株利用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定，同時(shí)將兩株缺失株與SL1344 分別接種于含1%麥芽糖的麥康凱固體培養(yǎng)基上，研究菌落生長(zhǎng)狀況;然后挑單菌落轉(zhuǎn)接含葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖糖等生化鑒定管，研究其生化特性。

1.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的生長(zhǎng)特性鑒定 將兩株缺失株與親本株SL1344 在LB 中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌生理鹽水連續(xù)10 倍稀釋，取100 μl 適當(dāng)稀釋度菌液均勻涂布于LB 固體平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算原液的CFU。然后以終濃度約為106CFU/ml 轉(zhuǎn)接于相同液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min 培養(yǎng)，每1 h 取樣并進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染小鼠后在體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布 6 周齡BALB/c 小鼠(16 只/每組)口服crp、sipB 缺失株1 ×107CFU，每周每組解剖4 只，共3組，并且取其肝、脾研磨進(jìn)行稀釋計(jì)數(shù)，連續(xù)測(cè)定4周，并設(shè)親本菌株對(duì)照組。

1.6 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞黏附試驗(yàn)感染前16 h 將細(xì)胞按照按每孔1 ×105細(xì)胞接種于24 孔板;將細(xì)菌調(diào)至OD600=0.4，用無(wú)抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗3 次，按100∶1 的細(xì)菌/細(xì)胞比例調(diào)整細(xì)菌濃度，加入1 ml/孔至細(xì)胞培養(yǎng)板，900 r/min離心10 min，37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次，加入300 μl 的胰酶作用5 min，再加入700 μl 5%BSAPBS 吹勻，稀釋涂板，培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)，以黏附的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算黏附率。每次試驗(yàn)重復(fù)2 孔，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞侵入試驗(yàn) 參照Dong［12］的方法將細(xì)胞按照每孔1 ×106細(xì)胞接種于6 孔板;將細(xì)菌調(diào)至OD600=0.4，用無(wú)抗生素的DMEM 培養(yǎng)基洗三次，按100∶1的細(xì)菌/細(xì)胞比例調(diào)整細(xì)菌濃度，加入1 ml/孔至細(xì)胞培養(yǎng)板，900 r/min 離心10 min，37℃5%CO2作用2 h;PBS 洗3 次，在PBS 洗3 次后，換含100 μg/ml 慶大霉素的DMEM 作用90 min;PBS 洗3 次，再加入1 ml 含0.1% Triton X-100 的PBS，吹勻，PBS 稀釋涂板，培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)，以侵入的細(xì)菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)計(jì)算侵入率。每次試驗(yàn)重復(fù)2 孔，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0 軟件進(jìn)行，各組間差異比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 或P＜0.01 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Δcrp 和ΔsipB 缺失株的表型鑒定 親本菌株SL1344 和SL1344ΔsipB 在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落，可利用麥芽糖，而SL1344Δcrp 不能利用麥芽糖，在含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無(wú)色菌落(見(jiàn)圖1)。生化試驗(yàn)結(jié)果表明，SL1344ΔsipB 利用碳源的能力與SL1344基本相同，但SL1344Δcrp 與親本菌株相比，只保留了利用葡萄糖的能力，不能夠利用半乳糖、麥芽糖、木糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇(表1)。

2.2 Δcrp 和ΔsipB 缺失株生長(zhǎng)特性鑒定 將缺失株SL1344Δcrp、SL1344ΔsipB 及親本株SL1344 菌液濃度均調(diào)整至1 ×106CFU/ml 為起始濃度開(kāi)始振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 取樣進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，SL1344ΔsipB 和親本菌株SL1344 生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯差異，而SL1344Δcrp 較親本菌株相比發(fā)生了顯著的降低(圖2)。

2.3 Δcrp 和ΔsipB 缺失株免疫小鼠后在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布 基因缺失株實(shí)驗(yàn)組和親本株對(duì)照組的小鼠均口服免疫1 ×107CFU 劑量的菌液，親本株在肝、脾內(nèi)的細(xì)菌數(shù)顯著高于各缺失株，并于1 周內(nèi)全部死亡。其中crp 基因缺失組在各臟器分離到的細(xì)菌數(shù)目高于sipB 缺失組，兩組實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌均是在肝中逐漸被清除，到第4 周被基本清除;在脾臟中的細(xì)菌到接種后第4 周仍保持低水平的細(xì)菌數(shù)(見(jiàn)表2)。

2.4 Δcrp 和ΔsipB 缺失株感染上皮細(xì)胞黏附和侵入試驗(yàn) 由圖3 可知，當(dāng)HeLa 細(xì)胞細(xì)胞形成單層后，以100MOI 的量接種親本株或缺失株細(xì)菌，黏附試驗(yàn)表明，sipB 基因缺失組的黏附率(圖3A)和侵入率(圖3B)顯著低于對(duì)照組，而crp 基因?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。

圖1 SL1344、SL1344ΔsipB 和SL1344Δcrp 在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of SL1344，SL1344ΔsipB and SL1344-Δcrp on medium

圖2 缺失菌株SL1344ΔsipB、SL1344Δcrp 與親本菌株SL1344 的CFU 生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of SL1344ΔsipB，SL1344Δcrp and SL1344 base on CFU

圖3 SL1344△sipB、SL1344△crp 和SL1344 對(duì)HeLa 細(xì)胞的黏附率和侵入率試驗(yàn)Fig.3 Adherence and intracellular assay of SL1344，SL1344△sipB and SL1344△crp to HeLa cells

表1 SL1344，SL1344Δcrp 和SL1344ΔsipB 生化特性比較Tab.1 Comparison of biochemical characteristics of SL1344，SL1344Δcrp and SL1344ΔsipB

表2 免疫后4 周內(nèi)細(xì)菌在BALB/c 小鼠體內(nèi)的分布Tab.2 Distribution of bacteria in BALB/c mice on 4 weeks post-inoculation

3 討論

鼠傷寒沙門菌具有非連續(xù)的侵入非吞噬細(xì)胞的能力，細(xì)菌的效應(yīng)蛋白穿過(guò)宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜主要由一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與完成的，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括SipB、SipC、SipD，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能形成一個(gè)通道使細(xì)菌的一些效應(yīng)蛋白通過(guò)細(xì)胞膜［13］。在沙門菌感染紅細(xì)胞過(guò)程中需要上述三個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白形成一個(gè)功能性小孔，它們?cè)谏抽T菌侵染哺乳動(dòng)物細(xì)胞過(guò)程中扮演著非常重要的角色［14］。其中SipB 是SPI-1 T3SS 的效應(yīng)蛋白，與細(xì)菌侵入有關(guān)。Santos 等［15］報(bào)道在鼠傷寒沙門菌感染牛巨噬細(xì)胞早期sipB 缺失株能夠顯著降低巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們?cè)谘芯窟^(guò)程中也發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌SL1344 株sipB 的基因缺失株能夠降低對(duì)小鼠的致病性，但機(jī)制尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建的缺失株進(jìn)行了后續(xù)研究。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，和sipB 同樣位于SPI-1 上的編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白crp 基因缺失株通過(guò)消除消除了細(xì)菌在哺乳動(dòng)物中攝取cAMP 的唯一途徑，影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達(dá)和降低其生長(zhǎng)增殖速度等途徑來(lái)降低其毒力［16，17］。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)crp 基因缺失株失去了利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力，并且生長(zhǎng)速度與親本菌株相比也發(fā)生了顯著的下降，兩者的結(jié)論相一致。而sipB 基因缺失株仍然保持著利用麥芽糖、半乳糖、山梨醇等的能力，并且其生長(zhǎng)速度較親本菌株相比沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明sipB 基因缺失后不影響菌株參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝等功能。通過(guò)構(gòu)建小鼠感染模型和上皮細(xì)胞感染模型對(duì)缺失株進(jìn)行侵襲力比較。在小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布結(jié)果表明缺失菌株較親本菌株相比在肝臟和脾臟分離到的細(xì)菌數(shù)明顯的低于親本菌株，并且均能很快地被清除，實(shí)驗(yàn)組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)sipB缺失組在各臟器分離到的細(xì)菌數(shù)低于crp 缺失組，說(shuō)明sipB 基因缺失實(shí)驗(yàn)組對(duì)小鼠內(nèi)臟器官的毒力和侵襲力下降更明顯，細(xì)胞的黏附和侵入試驗(yàn)結(jié)果顯示缺失sipB 基因后能夠顯著降低對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵入能力，而crp 基因缺失株實(shí)驗(yàn)組與親本菌株對(duì)照組無(wú)明顯差別，均與前面的小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果相一致。通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明sipB 基因缺失株可能是通過(guò)降低對(duì)機(jī)體的內(nèi)臟器官和上皮細(xì)胞的黏附和入侵能力來(lái)達(dá)到降低毒力的目的，而crp基因缺失株可能通過(guò)影響參與碳水化合物、氨基酸和小肽代謝的廣泛功能及影響菌毛與鞭毛的表達(dá)和降低其生長(zhǎng)增殖速度等途徑來(lái)降低其毒力。

［1］Paine NJ，Ring C，Bosch JA，et al.The time course of the inflammatory response to the Salmonella typhi vaccination［J］.Brain Behav Immun，2013，30:73-79.

［2］Lillard JJ，Boyaka PN，Singh S，et al.Salmonella-mediated mucosal cell-mediated immunity［J］.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)，2001，47(7):1115-1120.

［3］Kim JS，Kim BH，Jang JI，et al.Functional insight from the tetratricopeptide repeat-like motifs of the type III secretion chaperone SicA in Salmonella enterica serovar Typhimurium［J］.FEMS Microbiol Lett，2014，350(2):146-153.

［4］Obregon C，Dreher D，Kok M，et al.Human alveolar macrophages infected by virulent bacteria expressing SipB are a major source of active interleukin-18［J］.Infect Immun，2003，71(8):4382-4388.

［5］Kang HY，Dozois C M，Tinge S A，et al.Transduction-mediated transfer of unmarked deletion and point mutations through use of counterselectable suicide vectors［J］.J Bacteriol，2002，184(1):307-312.

［6］Myeni SK，Wang L，Zhou D.SipB-SipC complex is essential for translocon formation［J］.PLoS One，2013，8(3):e60499.

［7］Asakura H，Ekawa T，Sugimoto N，et al.Membrane topology of Salmonella invasion protein SipB confers osmotolerance［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，426(4):654-658.

［8］Han L，Zhen YH，Liang AX，et al.Oral vaccination with inhibin DNA delivered using attenuated Salmonella choleraesuis for improving reproductive traits in mice［J］.J Basic Microbiol，2014，54(9):962-968.

［9］Mukherjee S，Barman S，Mandal NC，et al.Anti-bacterial activity of Achatina CRP and its mechanism of action［J］.Indian J Exp Biol，2014，52(7):692-704.

［10］廖成水，程相朝，趙戰(zhàn)勤，等.鼠傷寒沙門菌SL1344 株cAMP受體蛋白基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011(12):1711-1716.

［11］陳松彪，李 靜，郁 川，等.鼠傷寒沙門菌SL1344 株侵襲性蛋白B 缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，34(2):215-220.

［12］Dong H，Peng D，Jiao X，et al.Roles of the spiA gene from Salmonella enteritidis in biofilm formation and virulence［J］.Microbiology，2011，157(Pt 6):1798-1805.

［13］Galan JE.Interactions of Salmonella with host cells:encounters of the closest kind［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(24):14006-14008.

［14］Lara-Tejero M，Galan JE.Salmonella enterica serovar typhimurium pathogenicity island 1-encoded type III secretion system translocases mediate intimate attachment to nonphagocytic cells［J］.Infect Immun，2009，77(7):2635-2642.

［15］Santos RL，Tsolis RM，Baumler AJ，et al.Salmonella enterica serovar typhimurium induces cell death in bovine monocyte-derived macrophages by early sipB-dependent and delayed sipB-independent mechanisms ［J］.Infect Immun，2001，69 (4):2293-2301.

［16］Alper MD，Ames BN.Transport of antibiotics and metabolite analogs by systems under cyclic AMP control:positive selection of Salmonella typhimurium cya and crp mutants［J］.J Bacteriol，1978，133(1):149-157.

［17］陳松彪，李 靜，尚 珂，等.雞白痢沙門菌C79-13ΔcrpΔasd平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30(8):1083-1087，1092.