遠程缺血后適應中大鼠海馬CA1 區TLR4 和IL-6 的表達變化及其意義

張 江 常莉莎 王大力 周 濤 劉會英 (華北理工大學附屬醫院神經內科二病區，唐山 063000)

遠程缺血后適應是指器官缺血后，對遠隔器官進行短暫的輕度的缺血再通，可起到保護作用［1］。研究表明肢端缺血可以減少海馬CA1 區的延遲神經元損傷［2］。但其機制尚不清楚。ILR4 為人體固有免疫的觸發因子［3］，參與介導對抗病原體的一系列炎癥反應，誘導促炎性細胞因子IL-6 等的釋放。鑒于上述過程是缺血再灌注損傷的重要機制之一［4］，本實驗在此基礎上，探討了遠程缺血后適應的腦保護作用與TLR4 和IL-6 表達的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備 72 只健康雄性SD 大鼠［自北京華阜康生物科技股份有限公司購買，實驗動物使用許可證編號:SCXK(京)2009-2004］，體重250～300 g，隨機分為假手術組(S 組)、對照組(C 組)、遠程缺血后適應組(P 組)，各組分為12、48、24、72 h 共4 個時間點組，每組6 只大鼠。應用改進的Longa［5］法，建立右側腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，小心分離右側頸總動脈和頸外動脈，線栓由頸總動脈進入頸內動脈至大腦中動脈，線栓頭端距血管分叉處約18 mm。2 h 后再次麻醉大鼠，C 組直接拔除線栓;P 組在拔除線栓后即刻用止血帶扎緊雙側后肢根部，扎緊/松開各10 min 循環3 次，此為RIP。假手術組只分離出各動脈，不置入線栓。以大鼠麻醉清醒后出現對側肢體癱瘓為標準。參照Zea Longa［5］的5 分制評分標準，剔除評分為0 分和4 分的大鼠，保證各小組6 只不變。

1.2 HE 染色及免疫組化染色 分別于各時間點將大鼠深度麻醉后，用4%多聚甲醛溶液行心臟灌流，斷頭取腦后行外固定。鼠腦做約2 mm 冠狀切片，常規石蠟包埋，制成厚約4 μm 的切片，取海馬最大的冠面切片用于HE 染色和免疫組化染色。

1.2.1 HE 染色 依照常規方法脫蠟、染色、脫水、透明、封片后，光鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化染色 TLR4 和IL-6 抗體均為兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(由北京博奧森生物有限公司)，稀釋度均為1∶200;PV6001 試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術有限公司。應用常規PV法:脫蠟至去離子水，枸櫞酸修復緩沖液行抗原高壓熱修復，自然冷卻至室溫，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS 緩沖液洗滌3 min ×3 次，滴加特異性抗體，4℃孵育過夜，PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次，PV6001 試劑盒中的試劑(抗兔抗體酶復合物)37℃孵育30 min，再次PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次，DAB 鏡檢控制顯色，流水沖洗3 h 以上去除DAB 殘留物，蘇木素復染，脫水、透明封片。光鏡下觀察。用PBS 代替一抗作陰性對照，以胞漿為棕黃色為陽性。每只大鼠取連續4 張相同部位的切片，每張切片在200 倍光鏡下隨機取海馬CA1 區的6 個不同視野，通過Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統統計每個視野的免疫組化陽性細胞數，取其平均數為該大鼠陽性細胞的表達數量。

1.2.3 Western blot 法檢測 TLR4 蛋白取腦組織標本與RIPA(用前加入PMSF 至終濃度為1 mol/L)組織裂解液按約1∶3的比例混合搗碎冰上裂解40 min，40℃離心15 min，取上清-20℃保存。BCA 蛋白濃度測定。

圖1 三組大鼠海馬CA1 區HE 染色結果(×200)Fig.1 Three groups of CA1 region of hippocampus in rats with HE staining(×200)

1.3 統計學分析 數據均采用SPSS17.0 統計軟件進行分析，計量資料用±s 表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬CA1 區HE 染色結果 S 組大鼠海馬結構清晰，CA1 區細胞形態正常，排列整齊，胞質染色均勻，胞核顏色正常，圓形或橢圓形，核仁明顯，核膜清晰(圖1A)。C 組大鼠海馬結構松散，CA1 區細胞稀疏，神經元明顯減少，可見較多的神經元胞體縮小，胞漿濃縮深染，胞核固縮，核仁核膜消失;也有的神經元腫脹淡染，呈三角形或者梭形;有的胞漿出現大片空泡區，提示腦水腫嚴重;有些區域出現小片壞死，細胞核碎裂甚至溶解消失(圖1B)。P 組大鼠海馬結構欠完整，但較C 組神經元缺失減少，胞體縮小深染現象明顯改善，神經元腫脹減輕(圖1C)。

2.2 各組大鼠海馬CA1 區免疫組化染色結果

2.2.1 TLR4 染色結果 在海馬CA1 區，S 組各時間點TLR4 表達水平均低。C 組與P 組TLR4 表達較S 組明顯增高(P＜0.05)。在C 組，TLR4 12 h 開始表達，24 h 達到高峰，72 h 開始下降。P 組TLR4陽性表達在72 h 前均低于C 組(P＜0.05)，而72 h時略高于C 組，但無統計學意義(P ＞0.05)。實驗結果提示缺血再灌注時，大鼠海馬CA1 區TLR4 被激活，但遠程缺血后適應使TLR4 的激活受到抑制而延遲。見表1，圖2。

表1 各組大鼠海馬CA1 區TLR4 陽性細胞表達數比較(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

表1 各組大鼠海馬CA1 區TLR4 陽性細胞表達數比較(±s)Tab.1 Comparison of number of positive expression of TLR4 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

Note:The observation time n=6;Compared with the sham group，1)P＜0.05;Compared with the control group，2)P＜0.05.

圖2 三組大鼠海馬CA1 區TLR4 表達結果(×200)Fig.2 Result of TLR4 expression in three group of rat hippocampal CA1 region(×200)

表2 各組大鼠海馬CA1 區IL-6 陽性細胞表達數比較(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

表2 各組大鼠海馬CA1 區IL-6 陽性細胞表達數比較(±s)Tab.2 Comparison of number of positive expression of IL-6 in hippocampus CA1 region of each group(±s)

Note:The observation time n=6;Compared with sham group，1)P＜0.05;Compared with the control group，2)P＜0.05.

表3 I/R 組和RPC 組大鼠海馬區TLR4 蛋白表達的相對吸光度比較(n=6，±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6，±s)

表3 I/R 組和RPC 組大鼠海馬區TLR4 蛋白表達的相對吸光度比較(n=6，±s)Tab.3 Comparison of relative absorbance of group I/R and group RPC in hippocampus of the rat TLR4 protein expression(n=6，±s)

Note:Compared with the control group，1)P＜0.05.

2.2.2 IL-6 染色結果 在海馬CA1 區，S 組各時間點IL-6 僅有少量表達。C 組與P 組有明顯的IL-6 表達，與S 組相比均有統計學意義(P＜0.05)。IL-6 在C 組12 h 開始表達，48 h 達到高峰，72 h 開始下降。P 組IL-6 陽性細胞表達在各時間點均低于C 組，有顯著統計學意義(P＜0.05)。實驗結果提示缺血再灌注時，大鼠海馬CA1 區的IL-6 被激活，但遠程缺血后適應使IL-6 的激活受到抑制。見件表2，圖3、4。

2.2.3 Western blot 定量檢測TLR4 表達結果Western blot 掃描圖片結果顯示:I/R 組和RPC 組TLR4 蛋白表達各時間點較Sham 組明顯增強。均在24 h 達高峰，48 h 后呈下降趨勢。RPC 組各時間點TLR4 蛋白表達較I/R 組減少，比較有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

3 討論

缺血再灌注所致的腦損傷，已被證明是影響關于血管再生預后的重要因素［6］，許多研究者都致力于尋找新的藥物和方法來保護腦組織免受缺血再灌注損傷。早在50 多年前，Sewell［7］及其同事就曾報道，間歇的再灌注(相當于目前的缺血后處理)，可以廢除心室顫動。直到2003 年Zhao 等［8］人提出“缺血后適應”這一假說后，缺血后適應的概念引起越來越多的重視。而如今，經典的缺血后適應已經延伸包括藥理學后適應和遠程缺血后適應。最早發現可以實施遠程缺血后適應的器官為腎臟，由Kerendi 等［2］通過短暫夾閉小鼠腎動脈而實現對小鼠缺血心肌的保護作用。接著肢體遠程缺血后適應的心肌保護作用也得到證實［9］。在腦缺血的研究中，也已有研究提示肢體的缺血后適應具有神經保護作用［10］。

圖4 各組不同時間點海馬TLR4 免疫印跡Fig.4 Each group at different time points in hippocampal TLR4 blotting

對于遠程缺血后適應的機制少有報道，目前普遍認為遠程缺血后適應的腦保護作用在于通過肢端、腎臟等短暫的缺血再灌注使心臟或腦產生對隨后而來的較嚴重缺血再灌注損傷的耐受能力，而缺血再灌注損傷的重要機制之一為免疫炎癥反應，TLR4 則是免疫炎癥反應的重要環節，內源性配體與TLR4 結合后發生結構改變，并募集髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation protein 88，MyD88)等轉接蛋白，通過MyD88 依賴或非依賴性信號轉導通路激活轉錄因子NF-κB 和干擾素相關蛋白(Interferon binding protein，IRFs)，進而誘導產生TNF-α，IL-1 和IFN-γ 等一系列炎癥細胞因子［11］。已有實驗證明，在樹鼩血栓性腦缺血的模型中，缺血后適應4 h 及24 hTLR4 蛋白表達減少，提示缺血后適應可能與調控TLR4 表達有關［12］。

本研究實驗結果顯示，大鼠腦缺血再灌注后12 h時TLR4 和IL-6 的表達已經開始增高，提示缺血再灌注損傷炎癥反應在12 h 已經啟動，TLR4 和IL-6 表達分別于24、48 h 達到高峰，與對照組相比，遠程缺血后適應組TLR4 表達在12、24、48 h 均受抑制，提示遠程缺血后適應的腦保護作用與抑制TLR4表達有關，而在72 h 表達水平與對照組相當，可能與腦缺血后期腦組織的自身修復有關。IL-6 在遠程缺血后適應中的表達于各時間點都低于對照組，提示其激活在遠程缺血后適應中受到抑制。

通過本實驗可以推斷遠程缺血后適應可以通過抑制TLR4、IL-6 相關的炎癥反應實現腦保護作用，為進一步明確遠程缺血后適應的分子機制以及臨床應用提供了依據。

［1］Gao XW，Ren CC，Zhao H.Protective Effects of Ischemic Postconditioning Compared With Gradual Reperfusion or Preconditioning［J］.J Neurosci Res，2008，86(12):2505-2511.

［2］Kerendi F，Kin H，Halkos ME，et al.Remote postconditioning:Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reduces myocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors［J］.Basic Res Cardiol，2005，100(10):404-412.

［3］McGettrick AF，O'Neill LA.Toll-like receptors:key activators of leucocytes and regulator of haematopoiesis［J］.Br J Haematol，2007，139(2):185-193.

［4］Qing W，Xiannan，Midori A，Yenari.The inflammatory response in stroke［J］.J Neuroimmunol，2007，3(20):53-68.

［5］Zea Longa E，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(5):84-92.

［6］Tjoumakaris SI，Jabbour PM，Rosenwasser RH.Neuroendovascular manage-ment of acute ischemic stroke［J］.Neurosurg Clin N Am，2009，20(8):419-429.

［7］Sewell WH，Koth DR，Huggins CE.Ventricular fibrillation in dogs after sudden return of flow to the coronary artery［J］.Surgery，1955，38(6):1050-1053.

［8］Zhao ZQ，Corvera JS，Haikos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(11):579-588.

［9］Li CM，Zhang XH，Ma XJ，et al.Limb ischemic postconditioning protects myocar-dium from ischemia-reperfusion injury［J］.Scand Cardiovasc J，2006，40:312-317.

［10］盧旭霞，牛小媛，羅玉敏，等.遠程缺血后適應對大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響［J］.中國腦血管病雜志，2013，7(3):139-142.

［11］N Zou，L Ao，Cleveland Jr，et al.Critical role of extracellular heat shock cognate protein 70 in the myocardial inflammatory response and cardiac dysfunction after global ischemia reperfusion［J］.American Journal of Physiology，2008，294(36):2805-13.

［12］馮 蕊，李樹清.缺血后適應對腦缺血樹鼩海馬TLR4 表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(10):1048-1052.