豬苓多糖誘導M2 亞型巨噬細胞向M1 巨噬細胞轉化①

江澤波 趙 晉 李思明 胡金萍 曾 星

(廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣州 510006)

多糖可活化機體免疫細胞，調節白介素及腫瘤壞死因子等細胞因子分泌，在機體抗腫瘤免疫調節等方面備受關注［1，2］，是目前常用的免疫調節劑。近期相關研究表明，豬苓多糖可以通過TLR4 信號通路活化巨噬細胞，刺激TNF-α、IL-1β 等炎癥因子分泌，并提高膀胱癌大鼠腹腔巨噬細胞CD86、CD40的陽性表達率［3-5］，但其對腫瘤相關巨噬細胞作用機制尚未明確。而腫瘤相關巨噬細胞類似于M2 亞型巨噬細胞，兩者均具有抗炎、降低腫瘤殺傷來保護機體［6-8］。本文借助腫瘤相關的M2 亞型巨噬細胞模型，觀察豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞膜表面分子和相關炎癥因子的作用，探討豬苓多糖啟動巨噬細胞可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞系RAW264.7 為廣東省中醫院中心實驗室提供。含丙酮酸鈉的高糖DMEM培養基、雙抗(Gibco)、胎牛血清(FBS)購于Hyclone 公司，TRIZOL 試劑購于Invitrogen 公司、逆轉錄試劑盒(Thermo)、熒光定量PCR 試劑盒(羅氏);流式抗體:CD16/32-FITC(ABCCM)，CD40-PECY5，大鼠IGg-FITC(eBiscience)，Rat IgG2a K Isotype Control PE-Cy5(eBioscience)，Rat IgG2a K Isotype Control RPE(ABCAN，USA)Rat IgG2a K Isotype Control FITC(eBioscience)，異丙醇、無水乙醇、氯仿(廣州化學試劑廠)，IL-4(Peprotech，USA);流式抗體CD23-PECY5，CD206-RPE(ABCAN，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 小鼠巨噬細胞株RAW264.7 用含100 ml/L 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 氯霉素的高糖DMEM 培養基37℃，50 ml/L CO2培養。實驗分為:空白對照組，IL-4 誘導的M2 亞型巨噬細胞，IL-4 +豬苓多糖低、中、高劑量組，豬苓多糖劑量分別為終濃度分別為50、100、200 μg/ml 的PPS 處理。

1.2.2 IL-4 誘導巨噬細胞株RAW264.7 為M2 亞型巨噬細胞及其檢測 M2 亞型巨噬細胞模型的構建，根據文獻［9］研究，給予終濃度為20 ng/ml 的細胞因子IL-4 誘導巨噬細胞株RAW264.7 極化為替代活化形式的M2 模式的巨噬細胞亞型。誘導24 h，然后收集細胞上清，PBS 洗滌巨噬細胞，消化調整數于流式管當中，加入2 ml 的PBS 洗滌細胞2 次，離心去掉上清，加入PBS 200 μl 重懸細胞，然后加入相應的抗體CD23-PECY5、CD206-RPE 和CD16/32-FITC 各1 μl，對應的同型作為陰性對照。4℃避光孵育30 min，然后PBS 離心去除游離的流式抗體，500 μl PBS 重懸細胞，于流式細胞儀中檢測相關膜表面分子的陽性表達率，膜表面分子蛋白特異性驗證M2 亞型巨噬細胞的極化成功。同時TRIZOL收集巨噬細胞，以qRT-PCR 檢測ARG1、IL-10、TGFβ、iNOSmRNA 的相對表達量，進一步驗證M2 亞型的構建成功。

1.2.3 豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞膜分子的影響 誘導小鼠巨噬細胞株RAW264.7 為M2亞型巨噬細胞后，給予相應的不同濃度的豬苓多糖溶液干預24 小時，收集細胞，PBS 洗滌細胞2次，調整細胞濃度，加入相應的流式抗體CD16/32、CD206、CD40 各1 μl，避光孵育30 min，然后加入PBS 洗去游離的流式抗體，加入500 μl 的PBS 溶液重懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞的膜分子的表達量。

1.2.4 qRT-PCR 檢測豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞細胞因子mRNA 的影響 IL-4 刺激24 h 的巨噬細胞去上清，加入相應的藥物進行干預24 h，然后每孔加入1 ml 的TRIZOL 反復吹打，收集細胞于無酶的1.5 ml 的EP 管當中，-80℃保存或者繼續提取總RNA。按照試劑說明提取總RNA，然后用紫外分光光度計檢測RNA 濃度和純度，按1 μg 的總RNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行擴增iNOS，IL-1β，IL-10，TNF-α mRNA 的基因編碼片段。基因引物序列分別為 mus-GAPDH Forward-5'-GTTTTCAG-GGATGAAGCGGC-3'，Reverse-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3';IL-10Forward-5'-TACTCGGCAAACC-TAGTGCG-3'，Reverse-5'-GTGTCCCAACATTCATAT-TGTCAGT-3';IL-1β Forward-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3'，Reverse-5'-CCATGGAATCCGTGTC-TTCCT-3';TNF-ɑ Forward-5'-GTGTCCCAACATTCA-TATTGTCAGT-3'，Reverse-5'-TGGGAAGAGAAACC-AGGGAGA-3';iNOS Forward-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3'，Reverse-5'-AGACCTCAACAGAGCC-CTCA-3'，ARG1 Forward-5'-TACAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3'，Reverse-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGC-CAA-3'。按照實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒的說明:2 × SYBR Green 10 μl、上下游引物終濃度0.4 μmol/L、cDNA模板10 μl、DEPC 水12 μl，反應總體系為20 μl。按照擴增試劑盒的程序:欲變性95℃10 min，變性95℃15 s，60℃34 s 退火，45 個循環。以GAPDH 作為內參，采用2-ΔΔCT法計算相對基因的表達量。

1.3 統計學分析 應用SPSS17.0 統計軟件，采用單因素方差分析對實驗數據進行處理，以P ＜0.05值為差異有顯著性。

2 結果

2.1 IL-4 誘導巨噬細胞極化為M2 鑒定指標 實驗結果如表1、圖1 所示，給予IL-4 誘導24 h 后，和未刺激的RAW64.7 比較，CD16/32 表達水平略高，但和空白對照組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05);而CD206分子表達顯著增高(P ＜0.05)，提示IL-4 誘導M2 亞型巨噬細胞成功。

表1 IL-4 誘導RAW64.7 極化為M2 亞型膜分子表達的情況(n=3，%)Tab.1 Expression of membrane surface molecules on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

圖1 IL-4 誘導的M2 亞型巨噬細胞膜表面分子CD206 和CD16/32 的陽性表達率Fig.1 Expression of CD206 and CD16/32 on IL-4-induced M2 macrophages

圖2 IL-4 誘導的M2 亞型巨噬細胞mRNA 表達量Fig.2 Expression of mRNA on IL-4-induced M2 macrophages

表2 豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞膜分子表達的影響(n=3，%)Tab.2 Expression of membrane surface molecules of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

表3 豬苓多糖對IL-4 誘導的模型細胞因子mRNA 的影響(n=3)Tab.3 Expression of mRNA of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3)

2.2 qRT-PCR 鑒定IL-4 誘導巨噬細胞極化為M2亞型巨噬細胞 如圖2 所示，給予IL-4 誘導巨噬細胞24 h 后，和空白對照組比較，ARG1 mRNA 的表達量明顯升高［(2.88±0.08)倍，P ＜0.01)］，IL-10 mRNA 的相對表達量升高了(1.89±0.15)倍，(P ＜0.01)，TGF-β mRNA 的相對表達量升高了(3.95±0.37)倍，iNOS 減低到(0.605±0.09)，和空白對照組比較，差異均具有統計學意義(P ＜0.01)。

2.3 豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞膜分子的影響給予豬苓多糖干預后，CD206 的表達量降低，CD16/32、CD40 的表達量升高，劑量依賴性明顯，和模型組比較，差異具有統計學意義(P ＜0.01)，詳見表2。

2.4 豬苓多糖對M2 亞型巨噬細胞模型細胞因子mRNA 的影響 從表3 可知:巨噬細胞模型予豬苓多糖干預后，相應的炎癥因子TNF-α、IL-1βmRNA的表達量升高，特異性M1 指標iNOS mRNA 呈現相似的趨勢，兩者與模型組比較，差異具有統計學意義(P ＜0.01);IL-10 的表達量隨著豬苓多糖劑量的升高而呈正相關趨勢。綜上可推測豬苓多糖通過提高炎癥因子的相對表達量來調節M2 亞型巨噬細胞生物活性。

3 討論

巨噬細胞是一種具有可塑性和多能性的細胞群體［10］，體內外局部微環境的不同直接影響巨噬細胞的分化和功能差異［11，12］，目前主要極化兩種亞型:經典M1 亞型(Classical activated macrophage)和替代M2 亞型(Alternative activated macrophage)，其中M1 亞型主要以抗腫瘤和增強免疫為主，M2 亞型則具有抗炎和介導腫瘤免疫逃逸作用。腫瘤微環境傾向于誘導巨噬細胞向M2 優勢活化，作為腫瘤組織中數量最多的抗原提呈細胞，M2 亞型巨噬細胞僅有較弱的抗原提呈能力，高表達CD23、CD206 等膜表面分子，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGFβ 等下調免疫應答，降低炎癥因子過表達對機體的損害［13，14］。在體外培養條件下，通過Th2 型細胞因子(如IL-4、IL-13 等)可誘導產生M2 亞型巨噬細胞［9］，并與體內極化的巨噬細胞具有高度相似的表型和功能，這也是目前研究巨噬細胞異質性的重要手段。

本研究采用經典的Th2 型細胞因子IL-4 誘導RAW264.7 巨噬細胞株24 h，極化后的巨噬細胞高表達M2 特異性的標志物ARG1，表明IL-4 誘導M2亞型巨噬細胞有效可行。造模成功后給予不同劑量的豬苓多糖干預，IL-10 等抑制性炎癥因子表達升高，并與濃度呈正相關，且M1 型巨噬細胞特異性的指標iNOSmRNA 同時明顯升高，結合既往文獻報道，可知豬苓多糖，尤其是高劑量豬苓多糖可促進巨噬細胞由M2 亞型轉換M1 亞型，起保護機體作用。隨后采用流式細胞術檢測了豬苓多糖干預細胞模型后的M1/M2 特異性的膜分子蛋白指標，可見M2 特異性指標CD206 表達率降低，而CD16/32、CD40 等M1 特異性指標反而升高，提示豬苓多糖可活化巨噬細胞由M2 亞型逆轉為M1 亞型，體現了人體免疫動態平衡的可控性，同時與機體免疫調節動態變化的連續過程相切合。結合qRT-PCR 檢測結果，發現豬苓多糖可以增加IL-1β，TNF-α 等相應炎癥因子水平，并提高M1 膜表面分子CD16/32、CD40 表達量，進一步驗證了豬苓多糖通過TLR4 途徑活化巨噬細胞的同時，可能通過過活化CD14 信號通路起作用。

綜上所述，豬苓多糖可有效活化巨噬細胞，起機體免疫調節，抗腫瘤作用。此外，豬苓多糖在抗熱休克蛋白過程中可增加抑制性細胞因子IL-10 的分泌而起減輕炎癥的作用，除外TLR4 途徑及CD14 信號通路，豬苓多糖是否可通過影響IL-10 相關通路來活化巨噬細胞，尚待后續實驗進一步驗證。

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