過表達ALEX1 對乳腺癌MCF-7 細胞增殖和凋亡的影響①

曾 帆 高 月 伍家燕 李海玉 樊建軍 李 韻 張寒韜 劉革力 宋方洲

(重慶醫科大學 基礎醫學院分子腫瘤研究中心，重慶 400016)

ALEX1(Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1)蛋白是Arm 重復蛋白家族成員之一，蛋白序列中含有兩個Armadillo repeat 結構，在蛋白N 端具有一個疏水的跨膜區［1］。Armadillo repeat 結構首次發現于果蠅極性基因armadillo，該基因在果蠅胚胎形成、維持上皮組織完整性和早期細胞極性形成中起重要作用，Arm repeat 家族在腫瘤形成、發展、細胞間通訊，維持組織完整性等多方面發揮著重要作用［2］。ALEX1 在正常組織中除肝臟、胸腺組織低表達，外周血白細胞未見表達外均有廣泛的表達;在上皮組織來源的腫瘤組織中低表達或不表達［3］，提示ALEX1 在上皮組織來源的腫瘤中可能充當抑癌基因起著重要作用。但其在乳腺癌中的研究國內外報道較少。本研究將重組慢病毒LV5-ALEX1 感染乳腺癌 MCF-7 細胞株，旨在探討ALEX1 基因過表達后對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，為進一步研究ALEX1 基因在乳腺癌中的作用及其機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 MCF-7 細胞由本實驗室保存，ALEX1、GAPDH 引物由TaKaRa 公司合成，RT-PCR 試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒SYBRGreen，ExTaq TM 聚合酶Ⅱ購自TaKaRa 公司。轉染試劑Lipofectamine 2000 和TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司;蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒和ECL 發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗人ALEX1 多克隆抗體購自Abcam 公司;HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體、兔抗人β-actin 多克隆抗體IgG購自北京中杉生物有限公司。重組慢病毒LV5-ALEX1 購自上海吉瑪公司。Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;流式細胞儀購自BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及感染重組慢病毒 將MCF-7 培養于含10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養基，37℃、飽和濕度、5%CO2，常規傳代培養。制成細胞懸液接種于6孔板中，當細胞長到50%～60%時，加入重組慢病毒LV5-ALEX1 懸液和陰性對照病毒LV5-NC 懸液，繼續培養。將LV5-ALEX1 作為實驗組，LV5-NC 作為陰性對照組。

1.2.2 Real-time PCR 檢測ALEX1 基因的表達 采用TRIzol 試劑盒提取感染過ALEX1 后72 h 的細胞總RNA，按試劑盒標準步驟操作。取1 000 ng 總RNA 進行逆轉錄，取1 μl 產物為模板進行熒光定量PCR 擴增，ALEX1 上游引物序列:5'-TGATATTCTGAGTGCTCCCGACC-3'，下游引物序列:5'-TGTTACCCAGAGTGACCAAGGCT-3';產物大小101 bp;GAPDH 的上游引物序列:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'，下游引物序列:5'-GTAGAGGCAGGGATGAGTTCT-3'，產物大小132 bp。PCR 條件:95℃10 s 后，40 個循環(變性95℃5 s、退火60℃15 s、延伸72℃15 s)，最后72℃10 min。每個樣本重復三次。通過比較CT 值法(2-△△CT)進行相對定量分析。

1.2.3 Western blot 法檢測ALEX1 蛋白及內源性凋亡通路相關蛋白水平的表達 MCF-7 細胞經感染處理72 h 后，收集各組細胞，裂解蛋白，BCA 法定量。取40 μg 蛋白樣品，經SDS-PAGE 分離后，電轉移至PVDF 膜上，經5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入兔抗人ALEX1(1∶500 稀釋)抗體，Bax(1∶1 000稀釋)抗體，BCL-2(1∶1 000 稀釋)抗體，Activecaspase3(1∶1 000 稀釋)抗體，兔抗人β-actin 多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，TBST 洗膜3 次，再分別與HRP 標記的山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL 化學發光。

1.2.4 流式細胞術檢測過表達ARMCX1 對MCF-7細胞凋亡的影響 轉染72 h 后，胰酶消化各組細胞，用冷PBS 重懸細胞，1 000 r/min 離心5 min，重復1 次，棄上清，再加入1 ml PBS 混勻，轉移至1.5 ml EP 管中。加入5 μl Annexin V-FITC，振蕩均勻后4℃孵育15 min，再加入5 μl 碘化丙啶(PI)，孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。

1.2.5 CCK8 法測定細胞的生長增殖情況 分別取對數生長期對照組和實驗組的細胞，以每孔5000個細胞接種于96 孔板中，每組3 個復孔。在細胞貼壁后每孔加入10 μl CCK8 試劑，37℃孵育2 h，在酶標儀上450 nm 測OD 值。分別檢測0、24、48、72、96 h 細胞生長情況。

1.3 統計學分析 應用SPSS17.0 統計軟件，數據均以±s 表示。兩組數據間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 重組慢病毒LV5-ALEX1 感染MCF-7 細胞效率 重組慢病毒感染MCF-7 細胞72 h 后，顯微成像系統觀察感染效率并拍照。結果顯示實驗組和對照組感染效率均達到90%以上(圖1)。

2.2 MCF-7 細胞經感染后ALEX1 mRNA 和蛋白水平的變化 Real-time PCR 和Western blot 檢測結果顯示，與陰性對照組相比，實驗組ALEX1 基因mRNA 和蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)(圖2、3)，表明ALEX1 被成功過表達。

圖1 熒光倒置顯微鏡觀察MCF-7 細胞轉染效率Fig.1 Infection efficiency of MCF-7 by fluorescence microscope

圖2 過表達ALEX1 對MCF-7 細胞ALEX1 mRNA 水平影響Fig.2 ALEX1 mRNA expression detected by realtime PCR

圖3 過表達ALEX1 對MCF-7 細胞ALEX1 蛋白水平影響Fig.3 ALEX1 protein expression detected by Western blot

圖4 過表達ALEX1 對MCF-7 細胞凋亡的影響Fig.4 Apoptotic cell numbers were determined by flowcytometric analysis

2.3 過表達ALEX1 后，MCF-7 細胞凋亡的變化 流式細胞術檢測凋亡結果顯示:對照組和實驗組的凋亡率分別為3.60% ± 1.614% 和20.55% ±2.50%，實驗組與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，表明過表達ALEX1 誘導MCF-7 細胞發生凋亡(圖4、5)。

2.4 過表達ALEX1 后，MCF-7 細胞的生長變化情況 CCK8 法檢測結果顯示:過表達ALEX1 48、72、96 h，實驗組較對照組MCF-7 細胞的生長明顯受到抑制(圖6)。

圖5 過表達ALEX1 對MCF-7 細胞凋亡影響統計圖Fig.5 Percentage of apoptosis in each group

圖6 CCK-8 檢測過表達ALEX1 對MCF-7 細胞生長的影響Fig.6 Effects of ALEX1 overexpression on cell growth in MCF-7 cells by CCK8

圖7 Western blot 檢測過表達ALEX1 對內源性凋亡通路相關蛋白的影響Fig.7 ALEX1 regulated the expression of apoptosis proteins

2.5 過表達ALEX1 后，內源性凋亡通路相關蛋白的變化情況 Western blot 檢測結果顯示:與對照組相比，實驗組中Bax 蛋白和Active-caspase3 蛋白表達量升高，BCL-2 蛋白表達量降低(圖7)。

3 討論

ALEX1 蛋白是Kurochkin［1］在用酵母雙雜交技術尋找與pp110 蛋白相互作用的蛋白時發現的。編碼ALEX1 基因全長為4.2 kb，含有四個外顯子，但編碼區全部位于第四個外顯子上。編碼453 個氨基酸，蛋白質分子量為49 kD，含有兩個arm repeat 結構。近年研究發現，ALEX1 mRNA 在心臟、腦、睪丸、前列腺、卵巢、結腸等大多正常組織組織中高表達。而在人腫瘤組織如肺癌、前列腺癌以及結腸癌中沒有表達，在胰腺癌和卵巢癌低于正常組織的表達［1，3-5］。在腫瘤細胞系中，ALEX1 mRNA 在膠質瘤細胞系和骨肉瘤細胞系中有表達，而在永生上皮細胞系、肺癌細胞系和乳腺癌細胞系中不表達，而在正常的乳腺上皮細胞系中有表達。這些研究表明ALEX1 基因有可能作為一種抑癌基因在腫瘤的發生發展中發揮作用。

為了探討ALEX1 基因是否作為抑癌基因在乳腺癌細胞中發揮生物學作用。本研究利用重組慢病毒LV5-ALEX1 感染MCF-7 細胞來過表達ALEX1，觀察對乳腺癌MCF-7 細胞的生物學行為的影響。2012 年，Hiroyoshi 等［5］報道，ALEX1 能夠抑制人直腸癌細胞的克隆形成，說明ALEX1 在直腸癌細胞系中抑制了細胞的增殖能力。本研究的結果發現，感染重組慢病毒LV5-ALEX1 的MCF-7 細胞在48，72，96 小時較陰性對照組細胞生長受到明顯抑制，與文獻報道一致，說明ALEX1 在乳腺癌的發病機制中可能扮演抑癌基因的角色。

細胞凋亡又稱程序性死亡，是機體為了調控自身發育，維護內環境穩定，由基因控制的細胞主動死亡過程。細胞凋亡參與機體許多病理生理過程，是抑制細胞增殖的一個重要原因［6］。本研究流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，過表達ALEX1 細胞凋亡率顯著增加，說明ALEX1 能夠誘導MCF-7 細胞發生凋亡。凋亡的產生受多種凋亡通路調控，其中重要的凋亡通路是線粒體調節的內源性凋亡信號通路。Bcl-2 基因家族在此凋亡通路中起著重要的作用，該家族包括抑制凋亡基因Bcl-2 和Bcl-xL，以及促凋亡基因Bax 和Bad［7，8］。其中Bax 的過表達可以促進細胞發生凋亡［9，10］，然而，Bcl-2 的過表達卻能抑制Bax 引起的細胞凋亡的功能［11］。Bax/Bcl-2比率的升高導致線粒體膜通透性增加引起細胞色素c 的釋放，最終激活Caspase3［12］。Caspase3 是半胱氨酸蛋白酶家族中導致細胞凋亡的最強大的最終效應因子，Caspase3 的激活最終誘導細胞發生凋亡［13］。本研究發現在乳腺癌MCF-7 細胞中過表達ALEX1，引起Bax 蛋白表達增加和激活Caspase3，同時降低了BCL-2 的蛋白表達量，我們推測ALEX1 很有可能通過上調Bax 蛋白的表達和降低BCL-2 的蛋白表達打開內源性凋亡通路的閥門，使得Caspase3活化，最終導致細胞發生凋亡。

本研究首次報道ALEX1 通過誘導細胞凋亡來抑制細胞的增殖，為進一步研究ALEX1 在腫瘤發生發展中作用機制奠定了理論基礎。同時，對ALEX1的深入研究有望推動以ALEX1 為治療靶點的藥物開發和基因檢測技術的研發。

［1］Kurochkin IV，Yonemitsu N，Funahashi SI，Nomura H.ALEX1，a novel human armadillo repeat protein that is expressed differentially in normal tissues and carcinomas［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，280:340-347.

［2］Hatzfeld M.The armadillo family of structural proteins［J］.Int Rev Cytol，1999，186:179-224.

［3］Iseki H，Takeda A，Andoh T，et al.Human Arm protein lost in epithelial cancers，on chromosome X1(ALEX1)gene is transcriptionally regulated by CREB and Wnt/β-catenin signaling［J］.Cancer Sci，2010，101:1361-1366.

［4］張 勇.人ALEX2 基因的克隆、表達與純化及生物信息學分析［J］.第四軍醫大學學報，2004，25(3):197-200.

［5］Hiroyoshi I，Akihiko T，Toshiwo A.ALEX1 suppresses colony formation ability of human colorectal carcinoma cell lines［J］.Cancer Sci，2012，103(7):1267-1271.

［6］Shapira A，Livney YD，Broxterman HJ，et al.Nanomedicine for targeted cancer therapy:towards the overcoming of drug resistance［J］.Drug Resist Updat，2011，14(3):150-163.

［7］Konopleva M，Konoplev S，HuW，et al.Stromal cells prevent apoptosis of Aml cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins［J］.Leukemia，2002，16(9):1713-1724 .

［8］Gbmez-Benito M，Marzo I，Anel A，et al.Farnesyltransferase inhibitor BMS-214662 induces apoptosis in myeloma cells through PUMA up-regulation，Bax and Bak activation，and Mcl-1 elimination［J］.Mol Pharmacol，2005，67(6):1991-1998.

［9］Martinez-Ruiz G，Maldonado V，Ceballos-Cancino G，et al.Role of Smac/DIABLO in cancer progression ［J］.J Exp Clin Cancer Res.2008，27:48.doi:10.1186/1756-9966-27-48.

［10］Kroková JZ，Massányi P，Sirotkin AV，et al.Nickel induced structural and functional alterations in mouse Leydig cells in vitro［J］.J Trace Elem Med Biol.2011，25(1):14-18.

［11］Mertens H J，Heineman M J，Evers J L.T he expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and ki 67 in endometrium of ovulatory menstrual cycles ［J］.Gynecol Obstet Invest，2002，53 (4):224-230.

［12］Zhang F，Kong DS，Zhang ZL，et al.Tetramethylpyrazine induces G0/G1 cell cycle arrest and stimulates mitochondrial-mediated and caspase-dependent apoptosis through modulating ERK/p53 signaling in hepatic stellate cells in vitro［J］.Apoptosis，2013，18:135-149.

［13］李 強，曹明溶，劉志龍，等.去氫駱駝蓬堿誘導HepG2 細胞凋亡并增強其對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性［J］.中國病理生理雜志，2013，29(2):284-289.