探索靜水高壓在研制黑色素瘤疫苗方面的應用

劉 凱 劉澤強 莊敏麗 潘月海 馬占川 劉 彬

(吉林大學第一醫(yī)院，長春 130000)

近年來黑色素瘤的發(fā)病率在全世界呈上升趨勢［1］。因此，黑色素瘤的防治已成為全球醫(yī)藥衛(wèi)生工作的重要任務。黑色素瘤易轉(zhuǎn)移、侵襲和復發(fā)等特性，使各種治療方法如手術、化療和放療均效果不佳。隨著人們對免疫系統(tǒng)認識的深入，用免疫方法防治腫瘤成為了熱點。腫瘤細胞表面抗原可被宿主的免疫系統(tǒng)所識別，運用免疫佐劑增強腫瘤抗原的免疫原性，誘發(fā)機體免疫應答，以達到防治腫瘤的目的［2，3］。

細胞破碎可釋放腫瘤抗原。常用的細胞破碎方法有機械、非機械兩種。靜水高壓屬于機械破碎，其破壞腫瘤細胞結(jié)構(gòu)，使其失去增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，但保留其免疫原性。細胞表面、胞內(nèi)蛋白經(jīng)高壓處理后可能會暴露相應的亞單位，進而增強免疫原性。本實驗采用靜水高壓、液氮反復凍融不同細胞破碎方法制成腫瘤疫苗免疫小鼠，通過小鼠體內(nèi)熒光成像、DTH 實驗等不同的指標檢測，進而比較兩種方法的優(yōu)劣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J 純系小鼠30 只，SPF級，購買于北京維通利華生物技術有限公司。雌性，體重(22 ±2)克。飼養(yǎng)于吉林大學第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學院。

1.1.2 實驗細胞株 鼠源性B16 黑色素瘤細胞株，含有免疫熒光基因的鼠源性B16 黑色素瘤細胞株，由吉林大學第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學院贈予。

1.1.3 其他實驗材料 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone 公司)，胰酶(HyClone 公司)，PBS 溶液(LEAGENE 公司)，臺盼藍染液，醫(yī)用三通，弗氏佐劑(Sigma 公司)，普通顯微鏡(Olympus 公司)，細胞培養(yǎng)箱(thermo 公司)，熒光素酶底物(PEL 公司)，小動物活體成像系統(tǒng)(Caliper 公司)，凍存管(CIRNING 公司)，超凈臺(thermo 公司)，DH600-0.8X2(9242)靜壓機(上海大隆高壓設備制造廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 腫瘤疫苗的制備 將液氮罐中取出的B16黑色素瘤細胞復蘇及數(shù)次傳代后，取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化細胞，離心后計數(shù)細胞濃度為1.6 ×107ml-1。使用3 個柔軟的無菌套分別盛裝1ml 細胞懸液放入靜壓機中，200 mpa 壓力破碎細胞30 min［4］。分別吸取1 ml 懸液于3 個凍存管中，液氮浸泡3 min，37℃水浴3 min，反復3 次。將高壓破碎與凍融破碎的細胞液用臺盼藍染色，在普通光學顯微鏡下見兩組均無完整細胞。將1.5 ml高壓破碎細胞液與同體積完全弗氏佐劑分別抽吸于兩個5 ml 玻璃注射器中，三通聯(lián)接兩注射器，反復抽推30 min，充分乳化。另取凍融破碎的細胞懸液、PBS 溶液分別充分乳化［5］。乳化后將一滴乳化液滴入純水中，若30 min 不散開，則證明乳化完全。

1.2.2 小鼠免疫 30 只小鼠打耳號，使用隨機數(shù)字表法分為6 組。每只小鼠背部皮下多點注射乳化液進行免疫，每只小鼠注射乳化液100 μl［5］。第1、3 組注射高壓破碎乳化液，第2、4 組注射凍融破碎乳化液，第5、6 組注射PBS 乳化液。初次免疫后第14、28 天分別再次免疫，再次免疫使用不完全弗氏佐劑，劑量同前。

1.2.3 小鼠腫瘤的接種及測量 最后一次免疫7 d后，用含有免疫熒光基因的鼠源性B16 黑色素瘤細胞接種小鼠。第1、3、5 組小鼠行尾靜脈注射濃度為1 ×106ml-1細胞懸液0.4 ml。第2、4、6 組小鼠在腹腔側(cè)方皮下注射相同濃度的細胞懸液0.1 ml。接種腫瘤后，每日觀察小鼠皮下是否長出瘤體。待長出瘤體后，用游標卡尺測量腫瘤的長徑與寬徑，并記錄每組小鼠生存時間。

1.2.4 DTH 反應 采用足墊腫脹試驗檢測特異性遲發(fā)型超敏反應(DTH)。將小鼠進行分組:高壓1組為高壓破碎免疫后尾靜脈注射腫瘤組，高壓2 組為高壓破碎免疫后皮下注射腫瘤組;凍融1 組為凍融破碎免疫后尾靜脈注射腫瘤組，凍融2 組為凍融破碎免疫后皮下注射腫瘤組;對照1 組為空白對照免疫后尾靜脈注射腫瘤組，對照2 組為空白對照免疫后皮下注射腫瘤組。小鼠在處死前1 d，于每只小鼠左前、后足墊分別注射1 ×105個(50 μl)細胞，24 h 后游標卡尺測量左、右足墊厚度，以兩足墊厚度差計算腫脹反應［5］。

1.2.5 小鼠體內(nèi)免疫熒光成像 小鼠稱重，按小鼠每克體重10 μg 劑量腹腔注射氯胺酮。待麻藥起效后按小鼠每克體重10 μg 劑量腹腔注射熒光素酶(Luciferase)。將小鼠放入活體成像系統(tǒng)進行體內(nèi)免疫熒光成像。曝光時間為1 min。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0 進行統(tǒng)計學處理。計量資料以±s 表示，組內(nèi)比較采用t檢驗，P＜0.05 表示兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮下腫瘤模型的建立 1 ×106ml-1的細胞液0.1 ml 接種于小鼠腹腔側(cè)方皮下，成功建立小鼠黑色素瘤腫瘤模型，建模后3 d 可觸摸到微小腫瘤結(jié)節(jié)，第5 天成瘤明顯，成瘤率為100%。

2.2 小鼠生存時間 小鼠生存時間為從接種腫瘤至小鼠死亡。由圖1 可見，高壓組小鼠生存時間最長，凍融組次之，而對照組最短。各組小鼠生存時間差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 各組小鼠生存時間Fig.1 Survival time of each group of mice

圖2 每組小鼠瘤體體積與生存期Fig.2 Tumor volume and survival time of each group of mice

2.3 小鼠瘤體體積與生存期 隔日用游標千分尺記錄腫瘤最長徑(L)和垂直方向最大橫徑(W)，依照下列公式計算腫瘤體積V=LW2/2(式中，V 為腫瘤體積，L 為腫瘤最長徑，W 為腫瘤垂直方向的最大橫徑)。接種腫瘤至動物死亡的時間為小鼠生存期。荷瘤時間以腫瘤可觸及時計算，直至動物死亡［6，7］。如圖2 所示，自測量腫瘤第7 天開始，3 組腫瘤體積差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 DTH 實驗 DTH 實驗是評價細胞免疫最直接、最常用的在體試驗，免疫效果可以通過產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應的強弱得到預測［5］。

如圖所示，高壓1 組、高壓2 組、凍融1 組、凍融2 組與對照1 組、對照2 組之間存在顯著性統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。而高壓組與凍融組之間無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)。

圖3 DTH 實驗每組小鼠前爪鼠墊厚度差值Fig.3 Difference of pad thickness of paw in mice after DTH experiment

圖4 DTH 實驗每組小鼠后爪鼠墊厚度差值Fig.4 Difference of pad thickness of hind paw in mice after DTH experiment

如上圖所示，高壓組、凍融組與對照組之間均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與對照組比較，各實驗組DTH 反應明顯升高(P＜0.05)，但有文獻表明:成瘤后隨著腫瘤的增大，DTH 反應呈下降趨勢［8］。

2.5 小鼠體內(nèi)熒光成像 尾靜脈注射腫瘤1 周后小鼠體內(nèi)并未檢測到明顯的熒光成像(圖5)，表明此時小鼠體內(nèi)并未形成明顯轉(zhuǎn)移瘤，或者形成轉(zhuǎn)移瘤但體積小熒光弱，被體表皮毛覆蓋。注射腫瘤2周后可檢測到熒光(圖6、7)。由圖6 可見，凍融組比高壓組熒光強度高、面積大，可見體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤生長較為旺盛。而高壓組比對照組熒光強度低、面積小，可見腫瘤生長受到限制(圖7)。

圖5 小鼠體內(nèi)熒光成像照片F(xiàn)ig.5 Photo fluorescence imaging in vivo

圖6 尾靜脈注射腫瘤2 周后成像圖片F(xiàn)ig.6 Imaging picture of tail vein injection of tumor after two weeks

圖7 尾靜脈注射腫瘤2 周后成像圖片F(xiàn)ig.7 Imaging picture of tail vein injection of tumor after two weeks

3 討論

黑色素瘤疫苗是利用腫瘤細胞或抗原物質(zhì)誘導機體產(chǎn)生特異性免疫反應，是一種主動特異性免疫治療方法［9］。全細胞破碎研制腫瘤疫苗其優(yōu)勢在于細胞表面所有潛在的相關抗原均有可能被加工和提呈，激活多克隆淋巴細胞，具有激發(fā)免疫反應的巨大潛力。

靜水高壓處理對于細胞膜的流動性、通透性以及細胞的顯微結(jié)構(gòu)都具有明顯的影響甚至破壞作用［10］，使腫瘤細胞隱藏亞單位結(jié)構(gòu)抗原位置暴露出來，增強了免疫原性。而且此方法制備疫苗具有不添加滅活劑、工藝簡單、生產(chǎn)周期短、成本低廉等優(yōu)點。由此可見，靜水高壓應用于制備疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。凍融法是將細胞凍結(jié)再融化，如此細胞膜親水性、通透性增加，細胞內(nèi)冰晶使細胞內(nèi)外產(chǎn)生滲透壓，并且胞內(nèi)形成的冰晶也會破壞細胞膜［11］。

腫瘤細胞表面抗原及胞內(nèi)蛋白經(jīng)高壓處理后，會使肽鏈的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露相應的功能單位及亞單位，增強了瘤苗的抗原性，從而可以有效地激活自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的活性，產(chǎn)生IFN-γ、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等細胞因子，利于樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)存活和分化［12］。樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)最高效能的抗原提呈細胞，在抗腫瘤免疫中處于核心地位［13］。而DC 激活的抗原特異性T 細胞通過釋放IL-2，又可以激活NK 細胞，使抗腫瘤的固有免疫應答和適應性免疫應答都得到活化和增強［14］。Rosenblatt等［15］認為將腫瘤細胞的全部抗原提呈給樹突狀細胞，從而激發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤反應，為T 淋巴細胞提呈了腫瘤的全套抗原，從而產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。而反復凍融可能在改變抗原蛋白空間結(jié)構(gòu)及暴露蛋白質(zhì)亞單位方面不如靜水高壓效果明顯。這可能是兩種疫苗效果差異的主要原因。另外反復凍融可產(chǎn)生許多細小冰晶，可能也對抗原蛋白產(chǎn)生了一定的影響。本實驗對靜水高壓在研制黑色素瘤疫苗方面的應用進行了初步探索，同時也存在研究上的幾個限制:小鼠的毛發(fā)、腫瘤表面組織及腫瘤的深度是否會對熒光成像結(jié)果產(chǎn)生影響，尚待進一步研究。腫瘤細胞在靜水高壓中的破碎方式是十分復雜的，不同的壓強是否會產(chǎn)生不同的免疫反應。并且全細胞疫苗中主要誘導機體產(chǎn)生免疫反應的成分，本實驗尚未闡明。且全細胞疫苗注入體內(nèi)是否會產(chǎn)生全身的遲發(fā)型超敏反應，尚且有待進一步研究。

［1］Mei HF，Jin XB，Shen J，et al.β-defensin 2 as an adjuvant promotes anti-melanoma immune responses and inhibits the growth of implanted murine melanoma in vivo［J］.PloS One，2012，7(2):e31328.

［2］Eun-Young Lee，Kyong-Su Park，Yong Song Gho，et al.Therapeutic effects of autologous tumor-derived nanovesicles on melanoma growth and metastasis［J］.PloS One，2012，7(3):e33330.

［3］Colavecchia SB，Jolly A，Mundo SL，et al.Effect of lipoarabinomannan from mycobacterium avium subsp auium in freund's incomplete adjuvant on the immune response of cattle［J］.Braz J Med Biol Res，2012，45(2):139-146.

［4］Wilton DJ，Ghosh M，Chary KV，et al.Structural change in a BDNA helix with hydrostatic pressure［J］.Nucleic Acids Res，2008，36(12):4302-4307.

［5］周 伊，齊 旭，王一理，等.不同佐劑增強小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤細胞免疫效應的比較［J］.腫瘤防治研究，2007，34(4):259-261.

［6］王淑瑞，齊 浩，郭 偉，等.B16 黑色素瘤移植模型的建立［J］.西安文理學院學報:自然科學版，2006，9(1):18-20.

［7］曾曙光，劉啟才，王素文，等.MtHSP70/HSV-tk 重組沙門菌抗小鼠黑色素瘤的作用［J］.南方醫(yī)科大學學報，2012，32(1):101-105.

［8］周 伊，齊 旭，王一理，等.新型佐劑SWZY 對弱免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗的免疫增強作用［J］.細胞與分子免疫學雜志，2006，22(4):526-529.

［9］于 靜，朱艷華，閻雪瑩.黑色素瘤治療方法的研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報(自然科學版).2014(3):266-270.

［10］白成科，李桂雙，段 俊，等.高靜水壓對水稻種子萌發(fā)及同工酶的影響［J］.高壓物理學報，2003，17(4):283-289.

［11］萬紅貴，郭一丹，鄭偉剛.幾種細胞破碎方法對提取S-腺苷甲硫氨酸的研究［J］.食品科技，2008，33(9):171-173.

［12］Granucci F，Zanoni I，Pavelka N，et al.A contribution of mouse dendritic cell-derived IL-2 for NK cell activation［J］.J Exp Med，2004，200(3):287-295.

［13］Ferrari S，Rovati B，Porta C，et al.Lack of dendritic cell mobilization into the peripheral blood of cancer patients following standard or high-dose chemotherapy plus granulocyte-colony stimulating factor［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52(6):359-366.

［14］Fehniger TA，Cooper MA，Nuovo GJ，et al.CD56 bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2:a potential new link between adaptive and innate immunity.［J］.Blood，2003，101(8):3052-3057.

［15］Rosenblatt J，Vasir B，Uhl L，et al.Vaccination with dendritic cell/tumor fusing cells results in cellular and homoral antitumor immune reponses in patients with multipul myeloma［J］.Blood，2011，117(2):393-402.